生物樣品的低溫保存概述
生命科學(xué)研究中組學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及臨床醫(yī)療領(lǐng)域新一代檢測技術(shù)的進(jìn)步，促進(jìn)了對生物樣品的需求，也促進(jìn)了生物樣品的采集、保存等環(huán)節(jié)的正規(guī)化、規(guī)模化。生物樣品的保存，不外常溫和低溫兩種方式。常溫保存能耗少、環(huán)保，有時也非常方便，是一種有潛力的保存方式。一些機(jī)構(gòu)正在積極探索不同的常溫保存技術(shù)。上海伯豪生物也推出了RNAsafety™這種可用于組織的常溫采集和保存的試劑。生物樣品的低溫保存，則是目前較常用的生物樣品保存方式。
生物和醫(yī)學(xué)上的低溫，是一個比較寬的溫度范圍。從大多數(shù)酶的最適反應(yīng)溫度37℃以下到幾個K（開爾文），都可以稱為低溫（絕對零度為-273.15℃ 即0K）。本文從樣品保存的角度，將低于常溫（室溫，25℃左右）的溫度理解為低溫。低溫能抑制生物體的生化活動，這是自然界固有的物理化學(xué)規(guī)律。根據(jù)阿侖尼烏斯（Arrhenius）方程，溫度越低，化學(xué)反應(yīng)速度越慢，樣品的保存時間越長。因此，為了使生物樣品在一定的時間內(nèi)保持穩(wěn)定，人們按不同需求將樣品保存在4℃，-20℃，-80℃ 或溫度更低的冰箱中，或者保存在液氮中。本文談?wù)勆飿悠返蜏乇４嬗绕涫莾龃鏁r需要注意的一些問題。
1. 長期保存的組織樣品要盡快凍存
樣品貯存的溫度對有效保存時間的影響很大。選擇合適的貯存方式和貯存溫度很重要。但為了保證實(shí)驗結(jié)果的客觀性，研究者也要充分注意樣品在貯存或固定前的處置時間和方式。樣品從開始收獲到固定或低溫保存前這段時間，仍有一些生化過程在較快地進(jìn)行。這些生化反應(yīng)的速度直到樣品被固定或者低溫保存時才顯著降低。這一段時間越短越好。對于手術(shù)切除的組織，熱缺血（warm ischemia）時間越短越好；對于實(shí)驗動物，處死取樣時掙扎時間越短越好。這有助于防止因環(huán)境改變而導(dǎo)致基因表達(dá)水平或蛋白磷酸化狀態(tài)產(chǎn)生較大變化。一些較復(fù)雜的手術(shù)可能進(jìn)行幾個小時甚至整天，那么最先被切割但未被切離的那部分組織可能經(jīng)歷較長的熱缺血時間，從而導(dǎo)致較大的生化變化。為了盡可能減少熱缺血的影響，一些手術(shù)室專門放置了液氮容器，組織一旦切下就被投入液氮進(jìn)行急凍（snap freezing）；對于耗時較長的手術(shù)，有人先在短時間內(nèi)切下有代表性的小部分組織用于研究，然后再進(jìn)行耗時較長的切除；有人在條件有限時，采用了將熱缺血狀態(tài)轉(zhuǎn)為冷缺血（cold ischemia ）狀態(tài)的辦法減少樣品的變化。他們先把切下的組織置于冰上或4℃ 冰箱中放置短時間，方便時再將樣品置于-80 ℃冰箱或液氮保存。總之，從樣品開始采集到被凍存或固定，這段時間越短越好，一般不要超過20分鐘。當(dāng)然不同組織生化過程的變化快慢有異。當(dāng)組織來不及凍存時，可將其剪成小塊，放于組織保存液如RNAsafety™中。
2. 樣品凍存的優(yōu)缺點(diǎn)
相比于FFPE樣品，凍存組織的DNA 和RNA的得率高，片段長，質(zhì)量好。可用于基因芯片和新一代測序等高通量基因組學(xué)檢測。不同于FFPE樣品，凍存組織內(nèi)的蛋白質(zhì)（如酶類）仍然保持生物活性，可用于某些檢測。但對凍存樣品，需要注意一些問題。凍存組織的形態(tài)學(xué)檢測效果有時不如FFPE樣品精細(xì)、完美（例如用于免疫組織化學(xué)檢測時）；某些病理組織內(nèi)的一些感染性因子凍存后仍然保持活性，處理這些樣品時需要格外注意；組織樣品中的RNA在-80℃ 凍存時仍然不是長期穩(wěn)定的，有人觀察到5年后RNA出現(xiàn)降解；核酸、蛋白質(zhì)等大分子經(jīng)過反復(fù)凍融，有可能斷裂成較小片段；凍存耗能較多，需要較多專門的空間，成本高昂；當(dāng)凍存設(shè)備發(fā)生故障時，大批珍貴的樣品有可能被破壞，從而導(dǎo)致巨大的損失；當(dāng)用液氮凍存樣品時，還要防范凍傷、液氮容器爆炸及因空間密閉等導(dǎo)致窒息等風(fēng)險。
3. 凍存溫度的選擇
前已述及，根據(jù)一般的物理化學(xué)規(guī)律，溫度越低，樣品的穩(wěn)定時間越長。在超低溫冰箱面世之前，-20℃ 冰箱是常用的低溫貯存工具之一。實(shí)踐證明，-20℃ 時組織內(nèi)的大分子仍然可以被降解。而且，0至-60℃ 是水的結(jié)晶溫度。結(jié)晶容易對細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)造成傷害，一般不在這一溫度范圍來保存組織和細(xì)胞。一些經(jīng)過提純的大分子可以在這一溫度范圍內(nèi)短期保存。目前，大多數(shù)生物和醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)用-80℃ 冰箱或液氮凍存生物樣品。-80℃低于危害性較大的結(jié)晶溫度范圍，也是常用設(shè)備超低溫冰箱能達(dá)到的溫度。但在-80℃溫度下，不同的生物樣品的保存時間是不一致的。組織中的DNA可以在-80℃下可以保持?jǐn)?shù)年或更長時間。組織中的RNA在-80℃下的穩(wěn)定性隨不同組織或細(xì)胞而異，但一般不超過5年。一些組織內(nèi)的RNA在-80℃下不到一年就發(fā)生了降解。為了長期保存組織內(nèi)的RNA，可以將組織切成尺寸小于0.5cm 的小塊，沒入5-10倍體積的RNAsafety™等組織培養(yǎng)液中，置于凍存管內(nèi)，冰凍保存。RNAsafety™溶液能夠較好地維持RNA的完整性。甚至那些已知RNA酶含量較高的組織中的RNA也可以在RNAsafety™保存液中得以長期凍存。下圖（圖1）顯示了上海伯豪生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的RNAsafety™組織保存液對組織內(nèi)RNA的低溫保存效果。
圖1. 用上海伯豪的RNAsafetyTM組織保存液低溫保存大鼠肝臟組織。在4℃和-70℃放置三個月后，指示RNA完整性的RIN值（縱坐標(biāo)顯示的數(shù)值）在7.0（紅線所示）以上。
值得一提的是，為了避免因反復(fù)凍融引起組織內(nèi)RNA的斷裂，有些研究者在短時間保存樣品時，采用組織保存液4℃保存，而不采用凍存法。
為了保持生物大分子的活性，也可以采用更低的溫度保存樣品。-137℃是水的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。在這個溫度以下，生化活動極大降低。因此，制冷溫度可達(dá)-140℃至-150℃的深低溫冰箱，以及液氮，成為一部分研究者的選擇。液氮貯存在液氮罐中時，為了避免氣化的部分引起爆炸，液氮罐口常保留一定縫隙。但這個縫隙也導(dǎo)致了液氮液面和液氮罐口之間形成一個溫度梯度（-80℃至-196℃，可認(rèn)為氣相氮溫度在-150℃左右）。為了避免樣本間的交叉污染，有些研究者傾向把樣品置于氣相中而不是液相中。但要注意液氮罐口的溫度是否達(dá)到了目標(biāo)溫度。還要注意液氮的消耗狀況和操作液氮罐的安全問題。
隨著制冷技術(shù)的進(jìn)步，深低溫冰箱已經(jīng)出現(xiàn)在某些實(shí)驗室。這類冰箱制冷溫度可達(dá)到-150℃。它不需要像液氮罐那樣需要頻繁監(jiān)控液氮消耗情況。箱內(nèi)溫度也比較均勻恒定，但深低溫冰箱降溫速度低于液氮，一旦開啟取放樣品時容易造成較大范圍的溫度波動，溫度恢復(fù)時間也相對較長。另外深低溫冰箱能耗很大，且必須保障供電。
有些生物樣品的保存需要更低的溫度。液氮的液相部分可提供-196℃ 的低溫。樣本內(nèi)的生化活動在此溫度下幾乎停止，樣本可以得到長期保存。液氮保存是樣品內(nèi)細(xì)胞活性、組織器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及活性最有效的長期保存方法。液氮保存被生物、醫(yī)學(xué)實(shí)驗室廣泛應(yīng)用。液氮液相保存樣品需要防止樣品間交叉污染，要注意凍存管的選用，也要注意安全問題。
干冰在生物可用于生物樣品的短時間內(nèi)的保存或運(yùn)輸。干冰自身溫度-78.5℃，呈固態(tài)，不滲漏，氣化后無毒，適于樣品的保存和運(yùn)輸。但干冰只能在短時間內(nèi)維持樣本的低溫，它自身不用于生物樣本的長期保存。另外，干冰的購買和伴隨運(yùn)輸會產(chǎn)生一定的額外費(fèi)用。在此我們建議在合適的情況下采用諸如之RNAsafety™類的化學(xué)保護(hù)劑代替干冰，進(jìn)行樣品的采集和運(yùn)輸。
4. 結(jié)語
生物樣品的低溫保存，是目前生物樣品的主要保存方式。在哪一溫度下進(jìn)行保存，需要結(jié)合樣品本身的性質(zhì)及實(shí)驗?zāi)康膩泶_定。一般來說，組織樣品內(nèi)的大分子比純化后的大分子不穩(wěn)定，RNA比DNA更易降解。組織樣品、細(xì)胞樣品的迅速采集、迅速凍存或固定對于保存生物大分子的完整性很重要。在進(jìn)行樣品的低溫保存時，輔以生物樣品保存液，例如RNAsafety™系列化學(xué)保護(hù)劑，可以幫助延緩大分子的降解進(jìn)程，得到較理想的研究結(jié)果。
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