蛋白質技術專題：蛋白等電聚焦凝膠電泳技術（一）
1.原理
等電聚焦凝膠電泳是依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離的技術，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為堿性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。
等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時，才能獲得較好的蛋白質條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統（否則會導致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時比較多種蛋白質樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。
由于等電聚焦對蛋白質的電荷差異非常敏感，若要好的重復性，制備蛋白樣品時一定要小心，要避免任何對蛋白質化學組成和結構的修飾。另外，蛋白質－脂類、蛋白質－蛋白質相互作用可引起電荷改變，進而導致等電點遷移或紋理現象。除非特殊需要研究蛋白質－蛋白質相互作用或者必須保持蛋白質的生物學功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統中進行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。
2.主要儀器、試劑
儀器：微型電泳系統、電源、注射器、固定和染色用容器
試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質、尿素、過硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巰基乙醇、溴酚藍、磷酸、氫氧化鈉、氯化鉀、三氯乙酸、考馬斯亮藍、甲醇、乙酸。
儲存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚藍；6）考馬斯亮藍染色液；7）考馬斯亮藍脫色液；
3.載體兩性電解質的選擇
載體兩性電解質是一些具有相近等電點的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時配置不同pH范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質的配方：
4.灌膠
以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來配置。
水：5.4ml； 儲存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過硫酸胺25μl； TEMED：20μl
灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質溶液混勻，避免劇烈搖動，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內（不要產生氣泡）；6）聚合約1小時；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前好用陽極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。
注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過程中會發生聚合；2）現在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.
樣品制備和上樣：
一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數目會有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔大上樣量大約15μl。
變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍：200μl
5.電泳
操作步驟：
1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質沉淀；2）用微量注射器將蛋白質樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來。注意：對于考馬斯亮藍染色液來說，每個泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。
電泳液：
1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲存液新鮮配置）；
2）下槽中加入陽極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲存液新鮮配置）。
等電聚焦電泳條件：
1）接好電極；
2）恒壓150V電泳30min；
3）恒壓200V電泳2.5h，開始時候控制電流為10mA左右，在聚焦過程中電流有所下降，電泳內室溫度在電泳的過程中將升至40－50攝氏度。
6．電泳聚焦后處理
測定pH梯度：
1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；
2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）測讀此KCl溶液的pH值、
凝膠的固定：
1）將凝膠于10%三氯乙酸中浸泡10min；
2）換成1%三氯乙酸溶液繼續浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質，浸泡過夜可以更好的降低考馬斯亮藍對載體兩性電解質的染色。
凝膠的染色：用考馬斯亮藍染色，然后脫色，制成干膠。
7.天然等電聚焦電泳的修正方案
如果要進行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；
1） 膠過程中配的凝膠中不需要加尿素；
2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質（同制膠成分），3ml甘油，上樣時候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；
3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。
等電聚焦凝膠電泳是依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離的技術，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為堿性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。
等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時，才能獲得較好的蛋白質條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統（否則會導致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時比較多種蛋白質樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。
由于等電聚焦對蛋白質的電荷差異非常敏感，若要好的重復性，制備蛋白樣品時一定要小心，要避免任何對蛋白質化學組成和結構的修飾。另外，蛋白質－脂類、蛋白質－蛋白質相互作用可引起電荷改變，進而導致等電點遷移或紋理現象。除非特殊需要研究蛋白質－蛋白質相互作用或者必須保持蛋白質的生物學功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統中進行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。
2.主要儀器、試劑
儀器：微型電泳系統、電源、注射器、固定和染色用容器
試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質、尿素、過硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巰基乙醇、溴酚藍、磷酸、氫氧化鈉、氯化鉀、三氯乙酸、考馬斯亮藍、甲醇、乙酸。
儲存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚藍；6）考馬斯亮藍染色液；7）考馬斯亮藍脫色液；
3.載體兩性電解質的選擇
載體兩性電解質是一些具有相近等電點的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時配置不同pH范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質的配方：
4.灌膠
以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來配置。
水：5.4ml； 儲存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過硫酸胺25μl； TEMED：20μl
灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質溶液混勻，避免劇烈搖動，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內（不要產生氣泡）；6）聚合約1小時；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前好用陽極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。
注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過程中會發生聚合；2）現在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.
樣品制備和上樣：
一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數目會有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔大上樣量大約15μl。
變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍：200μl
5.電泳
操作步驟：
1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質沉淀；2）用微量注射器將蛋白質樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來。注意：對于考馬斯亮藍染色液來說，每個泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。
電泳液：
1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲存液新鮮配置）；
2）下槽中加入陽極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲存液新鮮配置）。
等電聚焦電泳條件：
1）接好電極；
2）恒壓150V電泳30min；
3）恒壓200V電泳2.5h，開始時候控制電流為10mA左右，在聚焦過程中電流有所下降，電泳內室溫度在電泳的過程中將升至40－50攝氏度。
6．電泳聚焦后處理
測定pH梯度：
1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；
2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）測讀此KCl溶液的pH值、
凝膠的固定：
1）將凝膠于10%三氯乙酸中浸泡10min；
2）換成1%三氯乙酸溶液繼續浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質，浸泡過夜可以更好的降低考馬斯亮藍對載體兩性電解質的染色。
凝膠的染色：用考馬斯亮藍染色，然后脫色，制成干膠。
7.天然等電聚焦電泳的修正方案
如果要進行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；
1） 膠過程中配的凝膠中不需要加尿素；
2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質（同制膠成分），3ml甘油，上樣時候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；
3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。
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凝膠成像
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