蛋白質技術專題：蛋白等電聚焦凝膠電泳技術（二）
8.常見問題及解釋
1） 若產生模糊條帶則證明聚焦不完全，這可能是由于電泳中的問題或大分子蛋白質限制了其在凝膠中的遷移能力。若聚焦時間過長或過短，條帶的分辨率會下降。增加電壓梯度可以使帶形更加銳利。高分子量蛋白質在瓊脂糖凝膠中可以聚焦的更好。
2） 產生歪斜的條帶通常由于不正確的pH梯度，檢查電極是否潔凈，是否同凝膠鏈接良好，同時應該注意凝膠的邊緣效應。
3） 蛋白帶的紋理現象是等電聚焦中經常遇到的問題，可能是一下原因：
a，蛋白質聚集或沉淀（尤其在等電點附近），或上樣量過大，8M尿素通常用來防止蛋白質聚集，去垢劑Triton X－100和NP－40常用來防止膜蛋白的聚集，所以上樣前一定要離心以除去不溶解的顆粒；
b，樣品中殘存核酸，可以采用多種方法去除核酸污染，如酸抽提、鹽沉淀、核酸酶消化等；
c，蛋白質修飾，非超純級的尿素中的異氰酸鹽污染物可能導致蛋白質的氨甲酰化，預電泳可以去除異氰酸鹽，蛋白質樣品處理或儲存不當會發生包括Cys殘基氧化，Asn或Gln殘基去氨基化等修飾過程；
d，波浪形條帶常由于樣品中鹽濃度過高，有時候載體兩性電解質或電極液不純或電極不潔凈也會產生波浪形條帶；
e，電極同凝膠連接不平行，配置凝膠時候試劑不純，載體兩性電解質濃度過低可導致不均等的pH梯度，若凝膠堿性部分pH梯度丟失，其可能原因是陽極飄移，可以補充pH9－11的載體兩性電解質或進行非平衡pH梯度電泳；
f，染色時候高背景的產生可能由于固定后載體兩性電解質仍殘留于凝膠中，增加1％三氯乙酸的固定時間可解決；
g，蛋白質條帶丟失或過淡可能由于蛋白質分子量較低（<10kDa〉或蛋白質在固定中未被變性，增加三氯乙酸濃度或使用戊二醛固定即可；
h，復雜的蛋白質混合物等電聚焦后可以產生相互重疊的斑點，改變等電聚焦凝膠pH范圍可以解決此問題。進一步的蛋白質純化或沉淀處理可以避免重疊斑點的產生。
9．其他要注意的事項
1）等電聚焦后可用一根染色的細線（0.1mm）標出染料前沿的位置；
2）不同品牌的載體兩性電解質性質上有細微的差別，使用不同來源的載體兩性電解質凝膠時候蛋白質分離樣式略有差異，若要獲得好的重復性一般不要更換載體兩性電解質的品牌；
3）通常，窄范圍的pH梯度可以提高分辨率，但是需要時間也比較常，pH梯度范圍為2是較好的選擇；
4）由于電源和凝膠冷卻系統的限制，長的凝膠長度為8－10cm，實際上，分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好；
5）當等電聚焦電泳時間很長時候（>3000V·h），由于載體兩性電解質不穩定造成的陰極漂移將成為嚴重問題，陰極漂移會破壞pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，為了克服此問題，開發了一種較短時間（1600V·h）完成等電聚焦電泳的技術，即非平衡pH梯度電泳，這樣可以在高pH范圍內聚焦蛋白質，但該方法不能用來測定蛋白質等電點。
6）尿素可以促進蛋白質溶解，并消除蛋白質－蛋白質及蛋白質－脂類相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同時抑制陰極漂移，但是也要注意變性蛋白質的等電點可能同天然蛋白有所差異。
7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至終濃度8M，在高濃度的尿素下，SDS同蛋白質的相互作用極小。
8）在變性液中加入2%Triton X－100以保證蛋白質（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3－14等兩性離子去垢劑；
9）超薄凝膠（50-500um）比常用標準等電聚焦更有優勢，因為高電場強度和更佳的冷卻效果使聚焦速度更快，分辨率更高。
10）在聚丙烯酰胺等電聚焦凝膠中，高分子量蛋白質（>750kd）常常表現異常的遷移行為，瓊脂糖凝膠或瓊脂糖－丙稀酰胺凝膠較適用于高分子量蛋白質。
11） 考馬斯亮藍染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗滌凝膠10-30min可以進一步改善染色效果。SDS同載體兩性電解質結合后可以更好的去除載體兩性電解質。
10.固相pH梯度等電聚焦電泳
簡介：固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術，其所用的介質是一些具有弱酸或弱堿性質的丙稀酰胺衍生物，它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質一端的雙鍵可以在聚合中共價結合到聚丙烯酰胺介質中，其另一端的R集團為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度，所以固相pH梯度與載體兩性電解質pH梯度的區別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。固相pH梯度等電聚焦比傳統等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達到0.001pH，是目前分辨率高的電泳方法之一。
1） 若產生模糊條帶則證明聚焦不完全，這可能是由于電泳中的問題或大分子蛋白質限制了其在凝膠中的遷移能力。若聚焦時間過長或過短，條帶的分辨率會下降。增加電壓梯度可以使帶形更加銳利。高分子量蛋白質在瓊脂糖凝膠中可以聚焦的更好。
2） 產生歪斜的條帶通常由于不正確的pH梯度，檢查電極是否潔凈，是否同凝膠鏈接良好，同時應該注意凝膠的邊緣效應。
3） 蛋白帶的紋理現象是等電聚焦中經常遇到的問題，可能是一下原因：
a，蛋白質聚集或沉淀（尤其在等電點附近），或上樣量過大，8M尿素通常用來防止蛋白質聚集，去垢劑Triton X－100和NP－40常用來防止膜蛋白的聚集，所以上樣前一定要離心以除去不溶解的顆粒；
b，樣品中殘存核酸，可以采用多種方法去除核酸污染，如酸抽提、鹽沉淀、核酸酶消化等；
c，蛋白質修飾，非超純級的尿素中的異氰酸鹽污染物可能導致蛋白質的氨甲酰化，預電泳可以去除異氰酸鹽，蛋白質樣品處理或儲存不當會發生包括Cys殘基氧化，Asn或Gln殘基去氨基化等修飾過程；
d，波浪形條帶常由于樣品中鹽濃度過高，有時候載體兩性電解質或電極液不純或電極不潔凈也會產生波浪形條帶；
e，電極同凝膠連接不平行，配置凝膠時候試劑不純，載體兩性電解質濃度過低可導致不均等的pH梯度，若凝膠堿性部分pH梯度丟失，其可能原因是陽極飄移，可以補充pH9－11的載體兩性電解質或進行非平衡pH梯度電泳；
f，染色時候高背景的產生可能由于固定后載體兩性電解質仍殘留于凝膠中，增加1％三氯乙酸的固定時間可解決；
g，蛋白質條帶丟失或過淡可能由于蛋白質分子量較低（<10kDa〉或蛋白質在固定中未被變性，增加三氯乙酸濃度或使用戊二醛固定即可；
h，復雜的蛋白質混合物等電聚焦后可以產生相互重疊的斑點，改變等電聚焦凝膠pH范圍可以解決此問題。進一步的蛋白質純化或沉淀處理可以避免重疊斑點的產生。
9．其他要注意的事項
1）等電聚焦后可用一根染色的細線（0.1mm）標出染料前沿的位置；
2）不同品牌的載體兩性電解質性質上有細微的差別，使用不同來源的載體兩性電解質凝膠時候蛋白質分離樣式略有差異，若要獲得好的重復性一般不要更換載體兩性電解質的品牌；
3）通常，窄范圍的pH梯度可以提高分辨率，但是需要時間也比較常，pH梯度范圍為2是較好的選擇；
4）由于電源和凝膠冷卻系統的限制，長的凝膠長度為8－10cm，實際上，分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好；
5）當等電聚焦電泳時間很長時候（>3000V·h），由于載體兩性電解質不穩定造成的陰極漂移將成為嚴重問題，陰極漂移會破壞pH梯度，尤其是pH8以上的梯度，為了克服此問題，開發了一種較短時間（1600V·h）完成等電聚焦電泳的技術，即非平衡pH梯度電泳，這樣可以在高pH范圍內聚焦蛋白質，但該方法不能用來測定蛋白質等電點。
6）尿素可以促進蛋白質溶解，并消除蛋白質－蛋白質及蛋白質－脂類相互作用，可增加聚焦速度和提高分辨率，同時抑制陰極漂移，但是也要注意變性蛋白質的等電點可能同天然蛋白有所差異。
7）若蛋白溶液中含有SDS，可加入尿素至終濃度8M，在高濃度的尿素下，SDS同蛋白質的相互作用極小。
8）在變性液中加入2%Triton X－100以保證蛋白質（尤其是膜蛋白）的充分溶解，有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3－14等兩性離子去垢劑；
9）超薄凝膠（50-500um）比常用標準等電聚焦更有優勢，因為高電場強度和更佳的冷卻效果使聚焦速度更快，分辨率更高。
10）在聚丙烯酰胺等電聚焦凝膠中，高分子量蛋白質（>750kd）常常表現異常的遷移行為，瓊脂糖凝膠或瓊脂糖－丙稀酰胺凝膠較適用于高分子量蛋白質。
11） 考馬斯亮藍染色中，三氯乙酸固定后用0.25％SDS的乙醇：醋酸：水（33：10：57）溶液洗滌凝膠10-30min可以進一步改善染色效果。SDS同載體兩性電解質結合后可以更好的去除載體兩性電解質。
10.固相pH梯度等電聚焦電泳
簡介：固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術，其所用的介質是一些具有弱酸或弱堿性質的丙稀酰胺衍生物，它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質一端的雙鍵可以在聚合中共價結合到聚丙烯酰胺介質中，其另一端的R集團為弱酸或弱堿，可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系，利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度，所以固相pH梯度與載體兩性電解質pH梯度的區別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時候便形成pH梯度，不隨環境電場條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。固相pH梯度等電聚焦比傳統等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達到0.001pH，是目前分辨率高的電泳方法之一。
標簽：
凝膠成像
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com