CRISPR-Cas9技術(shù)徹底改變了基礎(chǔ)生物研究和應(yīng)用生物技術(shù)的許多領(lǐng)域。但在臨床基因治療實施中脫靶效應(yīng)的檢測仍然存在難題。德國漢堡大學(xué)-艾本多夫醫(yī)學(xué)中心（UKE）干細(xì)胞移植、細(xì)胞和基因治療研究所的學(xué)者們近日在知名雜志《Molecular Therapy》上發(fā)表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了稱為LATE（長期不良治療效果鑒定檢測）的新型檢測方法，該方法使用Stilla naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測低頻的脫靶事件，且有助于分析Cas9脫靶切割效應(yīng)的影響，并可在單細(xì)胞層面進(jìn)行評估。
 

為了證明LATE方法有助于檢測Cas9脫靶切割后的功能影響，研究人員進(jìn)行了小規(guī)模的原理驗證實驗：明星基因TP53基因敲除后會導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出相對生長優(yōu)勢，這是主要的致瘤性標(biāo)志之一，因此可以作為驗證“LATE”檢測脫靶能力的指示。本文選取TP53進(jìn)行CRISPR靶向?qū)嶒灒�并轉(zhuǎn)染到有限稀釋后的原代人類新生兒包皮成纖維NUFF細(xì)胞中，通過“LATE”方法重復(fù)檢測到低頻(<0.5%)生長促進(jìn)事件，這一結(jié)果證明了即使在低起始細(xì)胞數(shù)的情況下，LATE檢測也具有高靈敏度，并且可以對單個細(xì)胞進(jìn)行評估。
 

圖 1. LATE檢測原理
 

LATE檢測的原理包括 (1)用編碼熒光蛋白、設(shè)計的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人類新生兒包皮成纖維細(xì)胞 (NUFF)，(2) 使用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)率并連續(xù)監(jiān)控長達(dá)10周，(3)讀取結(jié)果，隨著轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量的增加，作為基因組編輯效應(yīng)的細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢
 

在這一過程中，“LATE”讀取到的陽性結(jié)果（獲得生長優(yōu)勢的細(xì)胞）會不會由TP53以外的基因被“脫靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突變，例如插入誘變從而導(dǎo)致細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢呢?為了研究“LATE”檢測的陽性結(jié)果與TP53插入缺失之間的聯(lián)系，研究人員設(shè)計了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）實驗，即Drop-Off分析方法，該方法可以量化gRNA結(jié)合位點以及脫靶位點的插入缺失頻率。
 

圖2. NUFF細(xì)胞獲得的生長優(yōu)勢與TP53中的插入/缺失頻率相關(guān) (A)TP53外顯子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX標(biāo)記探針的示意圖。(B) TP53插入/缺失頻率，數(shù)據(jù)由GFR-dPCR測量獲得。(C) 脫靶TP53插入/缺失頻率，由GEF-dPCR測量獲得。
 

對于TP53 gRNA結(jié)合位點的檢測，GEF-dPCR使用兩個雙標(biāo)記水解探針，一個HEX標(biāo)記探針與遠(yuǎn)離gRNA識別序列的區(qū)域結(jié)合，易發(fā)生插入缺失的位點設(shè)計FAM標(biāo)記的探針（圖2A）。

文中使用Stilla naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行GFR-dPCR方法檢測，實驗方法詳見原文第12頁。
 

隨后進(jìn)行Stilla naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測，結(jié)果顯示隨著時間的推移，TP53插入缺失的頻率隨之增加，轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天插入缺失率為1%–22%，在52天后達(dá)到44%–85%的峰值，該變化趨勢和細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢的趨勢一致。（圖2B）
 

研究人員還對TP53脫靶位點的插入缺失頻率進(jìn)行了檢測（圖2C）。上述dPCR檢測結(jié)果也與NGS測序方法和RGB熒光標(biāo)記方法一致，從而說明“LATE”能夠檢測TP53介導(dǎo)的gRNA的不良脫靶效應(yīng)，但這些gRNA并沒有被常用的在線預(yù)測工具標(biāo)記為“危險信號”。
 

隨后，作者還驗證了“LATE”可用于任何類型的設(shè)計核酸酶以及不同的CRISPR/Cas變體，并且可以擴(kuò)展用于其他細(xì)胞類型，尤其是高度相關(guān)的原代hMSC。因此，“LATE”實驗方案可用于驗證特定細(xì)胞類型中特定設(shè)計核酸酶的脫靶效應(yīng)的影響。
 

圖3：LATE檢測可應(yīng)用于hMSCs和h-TERT永生化細(xì)胞
 

綜上，“LATE”可以作為一種簡單、快速和經(jīng)濟(jì)的技術(shù)手段，用來評估CRISPR/Cas系統(tǒng)帶來的生理“副作用”影響，輔助臨床前的安全性研究，是對基于NGS的全基因組脫靶檢測方法的有效補(bǔ)充，特別是補(bǔ)充了流式和數(shù)字PCR的檢測結(jié)果。
 

原文:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.07.004
 

期刊介紹：《Molecular Therapy》是美國基因治療學(xué)會(ASGT)的月刊，是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、載體開發(fā)與設(shè)計、干細(xì)胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的開發(fā)、細(xì)胞療法、疫苗開發(fā)、臨床前目標(biāo)驗證、安全性/有效性研究和臨床試驗等領(lǐng)域的領(lǐng)先期刊。《Molecular Therapy》致力于促進(jìn)遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的科學(xué)發(fā)展，影響因子為6.698。