隨著針對PI3K通路的新療法的批準，PIK3CA突變的檢測已成為HR+/HER2- 轉移性乳腺癌 (MBC) 治療管理的關鍵因素。法國雷恩第一大學尤金馬奎斯癌癥中心在《Scientific Reports》上發表了一篇文章，該文章采用naica®微滴芯片數字PCR系統開發了多重PIK3CA突變檢測技術。該技術可同時檢測21種PIK3CA突變，并進行絕對定量，解決了當前對乳腺癌患者的21種PIK3CA致病突變進行快速、高靈敏、有效檢測的難題。

亮點

1.在naica®微滴芯片數字PCR平臺，使用液體活檢技術對21種PIK3CA突變進行定量檢測。

2. 通過對大量的腫瘤實體樣本和cfDNA樣本進行檢測驗證，獲得了83.1%的一致性，確定了此方案的臨床有效性。

3.naica^®微滴芯片數字PCR系統檢測方法的高靈敏度和穩定性，能夠快速、經濟、有效地對乳腺癌中最常見的PIK3CA致病突變進行絕對定量，覆蓋率達90%。

檢測方式

利用naica^®微滴芯片數字PCR系統(Stilla Technologies)，結合Drop-off檢測方法，設計了一種可以同時檢測21個PIK3CA突變的方法。在陽性分析案例中可精確識別PIK3CA突變。通過分析來自213個 HR+/HER2- MBC樣本的血漿循環游離DNA (cfDNA) 以及從89名患者的97個可用匹配腫瘤中提取的DNA，確定了此方案的臨床有效性，并在cfDNA分析和相應腫瘤樣本分析之間獲得了83.1% 的一致性。

該技術采用兩種Assay配合三步診斷策略（圖1，圖2），首先進行PIK3CA突變初步篩選，如果沒有PIK3CA突變，則認為標本為陰性。在陽性結果的情況下，進行第二步檢測集中于四種最常見的PIK3CA突變，并進行WT-MUT Duplex聯合分析確定陽性突變位點。

圖1左：PIK3CA突變檢測的兩種多重檢測方法設計圖。(a) PIK3CA Assay n°1設計圖:使用四對引物(灰色箭頭)同時擴增N345K、C420R、 H1047L和H1047R。使用Drop-off方法檢測542-546突變。(b) Drop-Off 542-546檢測原理: WT序列由HEX標記的Drop-off探針和cy5標記的reference探針檢測，產生一簇HEX-Cy5雙陽性微滴(2D點圖上為黃色簇);而542 - 546密碼子上帶有突變(MUT，紅色叉)的序列則無法與Drop-off探針結合，只和reference探針結合，生成單陽性微滴(2D點圖上的紅色簇) (c) PIK3CA Assay n°2設計圖:使用兩對引物同時擴增兩個序列，使用FAM探針標記野生型(WT)序列，使用HEX探針標記E542K和E545K突變，使用FAM和Cy5探針標記H1047L突變，使用Cy5探針標記H1047R突變；圖一右：三步診斷策略。

圖2：使用PIK3CA檢測在患者cfDNA樣本上鑒定PIK3CA突變示例。(a)四種最常見的PIK3CA 突變（E542K、E545K、H1047L和H1047R）的2D圖結果，首先使用PIK3CA Assay n°1檢測，各自的MAF為16.86%、4.17%、17.13%和1.97%。并使用PIK3CA Assay n°2確認，各自的MAF分別為17.40%、5.25%、19.55%和1.97%。(b)其他突變（N345K、C420R、Q546K、Q546P和Q546R）的2D圖結果，首先使用PIK3CA Assay n°1檢測，各自的MAF為4.00%、3.83%、35.02%、1.16%和39.2%，并使用WT-MUT Duplex方法確認，各自的MAF分別為6.99%、6.50%、36.84%、0.71%和43.89%。

結果分析

結果顯示，213份血漿中68名患者(32%)至少有一種突變，這與文獻中普遍報道的結果一致。有6例患者每個樣本有2個突變，共發現74個突變。在本文的檢測方法可能檢測到的21個突變中，有9個在血漿樣本中檢測到（圖3a、b）。此外,本方法檢測的相對頻率與COSMIC數據庫中列出的頻率相當一致，該方法能夠快速、經濟、有效地對乳腺癌中最常見的PIK3CA致病突變進行絕對定量，覆蓋率達90%

圖3：213例HR + /HER2−轉移性乳腺癌患者血漿中PIK3CA突變檢測(a)在213例HR + /HER2−轉移性乳腺癌患者中，PIK3CA檢測發現9個PIK3CA突變陽性病例數。(b)確定的9個PIK3CA突變的相對頻率。(c)突變在血漿中濃度（copies/ml）和MAF(%)分布 (5例以上的突變用箱線圖表示，5例以下的突變用點表示，2例以上的突變用中位數線表示)。

原文：https://doi.org/10.1038/s41598-021-96644-6

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法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數字PCR系統，源于Crystal微滴芯片式數字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數濃度。