文章標題：He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway

發表期刊：Phytomedicine
發表時間：2021.10.24
影響因子：5.340
合作客戶：廣州中醫藥大學第一附屬醫院
百趣生物提供服務：中藥非靶（UPLC-MS）
分組情況：模型組、陽性對照組、HCP[L]組、HCP[M]組、HCP[H]組
分析圖：總離子流圖、成分鑒定表

研究背景

非小細胞肺癌（NSCLC）是危害最大的惡性腫瘤之一，在全球范圍內發病率和死亡率最高。NSCLC的治療方式主要包括手術切除、化療、放療、靶向治療和免疫治療。

近年來中醫藥（TCM）越來越多地用作肺癌的輔助治療。研究表明，GREM1在腫瘤的轉移過程中發揮重要的作用，HCP也顯示出對肺癌患者的巨大臨床益處。但是相關的抗腫瘤作用的分子機制尚未得到很好的表征。本研究致力評估HCP的作用和GREM1在NSCLC轉移中的作用。

研究內容

動物實驗
向40只裸鼠體內注射A549細胞建立腫瘤模型，成功后將裸鼠分為5組：模型組、HCP（L）組、HCP（M）組、HCP(H)組和陽性對照組（DDP）。之后分別對各組裸鼠進行不同方式不同劑量的給藥培養，持續給藥21天

血清中HCP的分析
從處理過的裸鼠血清中鑒定出 36種HCP的主要成分/代謝物，36種主要成分和代謝產物中有10個單體具有抗腫瘤功能：毛豆素、肉豆蔻酸、 picein、resistogenin、14-脫氧穿心蓮內酯、celastrol 、脫氫樅酸、肉桂酸、芹菜素-7 - O-葡萄糖苷和棕櫚酸。這些發現提供了對 HCP 抗腫瘤作用因素的深入了解
 

圖1 血清中36種HCP組分的TIC圖（A）為空白血清,（B）為含HCP血清

HCP在體外抑制肺癌腫瘤生長，無肝腎毒性
在第7天，HCP (M)、HCP (H) 和DDP 組的腫瘤體積較低（圖2A ）。在第14天，HCP（M）和HCP（H）組的腫瘤體積顯著低于其他組，并且隨著劑量的增加，腫瘤體積有減小的趨勢（圖2B）。在第21天，HCP (H) 組的腫瘤重量和體積顯著下降（圖2C、D）。在治療的21天期間，所有組的體重都有增加的趨勢（圖2E）。治療21天后，HCP（H）組的體重變化明顯低于對照組（圖2F）。HCP（L）、HCP（M）、HCP（H）和DDP組在治療后腫瘤抑制率（IRs）分別為6.51%、14.58%、29.38%和36.40%。治療21天后，各組之間的肝臟或腎臟指標沒有顯著差異（圖2G、H）。

解剖過程順利，腫瘤可完全分離。可以清楚地區分腫瘤組織和周圍組織。腫瘤質地較硬，邊界清晰。模型組的體積高于其他組。切片并用H＆E染色后，癌細胞大且異形，細胞核大且染色強烈。模型組腫瘤細胞排列緊密，細胞核多，形態清晰。DDP組腫瘤細胞分布較松散，細胞相對較少。與模型組相比，HCP處理組異常細胞相對較少，細胞密度較松散（圖2I）。觀察各組肝組織切片。每組小鼠的肝小葉是完整的，肝細胞沒有放大，細胞核定位在中間，細胞間隙清楚，而且沒有明顯的異常（圖2J）。各組腎組織切片未見明顯病理改變。腎小球中發生病變的膜細胞或內皮細胞沒有增加（圖2K）。
 

圖2 HCP體外抑制肺癌腫瘤生長，對肝、腎無毒性作用。(A)(B)(C)(D)為不同時間腫瘤體積/重量圖，(E)(F)(G)(H)為重量變化圖，(I)(J)(K)為組織切片染色圖

HCP 抑制 EMT、GREM1 水平和相關通路
Western印跡表明HCP（H）組波形蛋白和N-鈣粘蛋白水平顯著低于模型組。HCP (M)、HCP (H) 和DDP組的蝸牛水平顯著降低。HCP（H）和DDP組的E-鈣粘蛋白水平增加（圖3A、B）。蛋白質芯片數據表明 14 種蛋白質表現出差異表達（4 種下調和10種上調）（圖3C）。上調的蛋白質之一是GREM1，它由GREM1基因編碼，與癌轉移密切相關。高通量測序揭示了1121個差異表達的基因（441個下調和680個上調）（圖3D）。Rap1 信號通路表明，GREM1表達受 miR-205-5p 調節（圖3E）。因此，HCP通過調節Rap1信號通路發揮抗腫瘤作用，GREM1是NSCLC轉移的重要治療靶點。
 

圖3 HCP可抑制EMT、GREM1表達及相關通路(A)(B)為蛋白水平結果，(C)(D)為層次聚類熱力圖，(E)為通路圖

GREM1通過調節EMT和Rap1通路促進轉移
使用CCK-8測定評估GREM1對A549細胞增殖的影響。A549細胞中的OE-GREM1沒有顯著抑制或促進增殖（圖4A）。用shGREM1轉染A549細胞時，觀察到相同的結果（圖 5A）。使用傷口愈合和Transwell測定探索了GREM1對轉移的影響。OE-GREM1顯著增加了A549細胞的遷移和侵襲（圖4B、C）。當用shGREM1轉染A549細胞時，遷移和侵襲顯著減少（圖5B 、C）。這些數據證實GREM1促進了NSCLC細胞的轉移，并沒有顯著增加細胞增殖。

為了進一步探索GREM1對轉移影響的潛在機制，作者研究了其在EMT中的作用。隨著GREM1表達的增加，間充質標志物（包括波形蛋白、Snail 和N-鈣粘蛋白）的蛋白質水平顯著增加。相比之下，上皮標志物E-鈣粘蛋白的水平急劇下降（圖4D）。在用shGREM1處理的A549細胞中，間充質標志物的表達被抑制，上皮標志物的表達顯著增加（圖5D）。因此，GREM1可能通過促進EMT進展來促進NSCLC的遷移和侵襲。作者進一步研究了Rap1相關信號通路組分（Rap1、c-raf 和 erk1/2）在NSCLC中響應GREM1的變化。結果發現GREM1過表達顯著增加了Rap1通路中信號蛋白相關基因的表達（圖4D），反之亦然（圖5D）。因此，這些結果表明GREM1在Rap1通路的調節中起重要作用，并可能通過激活該通路促進NSCLC的轉移。
 

圖4 OE-GREM1通過Rap1途徑調節EMT進展，促進A549細胞轉移

圖5 ShGREM1通過Rap1通路調節EMT進展來影響A549細胞的轉移

GREM1不促進A549異種移植小鼠模型的增殖
為了檢查GREM1在體內A549細胞生長中的作用，作者使用裸鼠進行異種移植腫瘤測定（圖6A-B）。OE-GREM1穩定轉染的A549細胞小鼠的體重與其他組沒有顯著差異（圖6C ）。然而，在第42、46和48天，HCP治療的OE-GREM1組的腫瘤體積和腫瘤生長低于其他組。在第48天，該組的腫瘤體積和重量顯著低于對照組（圖6D、E）。這些數據表明GREM1不促進體內A549細胞生長。

MiR-205-5P直接調節GREM1表達
為了驗證miR-205-5P是否與GREM1相互作用并抑制其表達，作者構建了表達 WT和突變體GREM1的質粒。雙熒光素酶報告系統用于確定GREM1表達。與 miR-205-5p模擬物共轉染的GREM1的熒光比率顯著降低（圖6F、G）。這些發現表明GREM1促進NSCLC轉移，其表達受到miR-205-5P的負調控。
 

圖6 OE-GREM1不影響A549異種移植裸鼠模型的增殖，而miR-205-5P直接調控GREM1的表達

結 論

從HCP處理的小鼠血清中分類出36種成分。HCP可以在一定程度上減緩裸鼠皮下移植腫瘤的生長速度。HCP對肺癌小鼠模型的肝臟和腎臟沒有影響，沒有觀察到副作用。HCP的作用方式可能與其通過miR-205-5p調控的Gremlin/Rap1信號通路抑制NSCLC轉移有關。

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