高通量蛋白質組分析
速度“更快”！鑒定數量“更高”！

靈敏度（尤其是MS/MS靈敏度）是蛋白質組學實驗的關鍵性能指標，高靈敏度的MS/MS為蛋白質鑒定（ID）提供了廣泛而深入的覆蓋。ZenoTOF 7600系統使用Zeno trap技術，在整個碎片離子質量范圍內增加占空比≥90%，在MS/MS模式下獲得4-25倍的增益3，這些提升可以在蛋白質組學發現研究中提供出色的表現。

在分別激活和不激活Zeno 阱的情況下，上樣400 ng K562細胞裂解液進行10分鐘液相梯度的MS/MS信號采集。粉色曲線為開啟Zeno阱的MS/MS總離子色譜圖，藍色曲線為關閉Zeno阱的MS/MS總離子色譜圖（圖1）。當使用Zeno阱時，TIC高度顯著增加。此外，MS/MS的譜圖質量也大大提高。
 

圖1.  在Zeno 阱激活和未激活時400 ng K562 細胞裂解液在10 min液相梯度中采集的數據對比。
 

通量也是蛋白質組學研究中非常重要的因素，ZenoTOF 7600系統配備微升流速液相體系，在短梯度內也能達到較高的肽段鑒定數量，并且開啟Zeno阱的功能有助于提高肽段鑒定。在上樣200 ng K562細胞裂解液時，對比Zeno 阱開關時肽段鑒定數量，可以看到，在所有梯度內，Zeno阱的激活都有助于鑒定數量的提升，在20 min以上的有效梯度中，Zeno阱的激活可以使肽段鑒定數量增加超過55%（圖2）。
 

圖2. 激活Zeno阱后肽段鑒定數量增加。在global FDR 為1%時，200 ng K562細胞裂解液在不同梯度中的肽段鑒定數量。Zeno阱大大增加了所有梯度中的肽段鑒定數量。
  

Zeno阱的應用對于蛋白質和肽段數量的鑒定都有很大程度的提高，通過對比ZenoTOF 7600系統與TripleTOF™ 6600系統，無論在短梯度和長梯度中，相同進樣量時7600系統鑒定到的蛋白數量和肽段數量都超過6600系統。

圖3. 在10min （左側）和45min （右側）梯度中ZenoTOF 7600系統與TripleTOF 6600系統鑒定到肽段和蛋白質數量對比。與TripleTOF 6600系統（紅色）相比，ZenoTOF 7600系統（藍色）鑒定出更多的肽段和蛋白質。
 

大規模蛋白質和多肽定量分析
靈敏度“更高”！速度“更快”！

 

ZenoTOF 7600系統具有較高的分辨率、更高的選擇性、TOF MS/MS數據的靈活性，還可提供出色的多維度定量性能。使用Zeno MS/MS，質荷比300以上的肽段離子的理論靈敏度提高了4-6倍3。采用Zeno trap關閉與Zeno trap打開的最終測定方法對804個肽段進行了對比實驗，并評價了MS/MS靈敏度（圖4）。所監測肽段的靈敏度符合預期，平均峰面積提高約5倍。
 

圖4. 激活Zeno trap后多肽峰面積顯著增加。（上圖）顯示了ANT3.PFLVFIR 激活Zeno trap時觀察到的靈敏度提高的示例數據，峰面積提高約6 倍。（下圖）匯總展示了所有 804 種肽檢測到的靈敏度數據，通過前體離子m/z提取數據，平均提高為 5.6倍。
 

為了使用僅20分鐘的快速梯度執行如此高度多重的分析，必須具有高度可重現的色譜和良好的峰形，以便可以使用非常窄的預定時間窗口（圖5）。在捕集-洗脫模式下，整個梯度的保留時間標準偏差大多小于2秒。建立了最終的 804 種肽Scheduled MRMHR檢測方法后，同時評估了肽段定量的重現性。10 次重復進樣中，804 種肽段在加入酶解的人血漿基質后的每種肽的中值%CV為 6.1%，表明這種 804 種重標肽的高度多重分析具有極高的重現性，97.9% 的多肽的 %CV 小于 20% （圖6）。
 

圖5. 10 次血漿樣品重復的色譜峰重現性。（上圖）在整個方法開發和最終數據生成過程中都檢測到了非常好的色譜重現性，804 種肽段和所有 10次重復的平均%RSD 為 0.23。（下圖）運行中檢測到的保留時間標準偏差與檢測到的保留時間圖，顯示大多數峰在 10 次重復中的偏移小于幾秒。

 

翻譯后修飾（PTM）在多種生物學過程中扮演重要角色，包括蛋白質構象和信號轉導等等。賴氨酸酰化，例如丙二酰化，是一種部分受Sirtuin（SIRT）蛋白質家族的成員賴氨酸脫酰酶調節的PTM。在之前一項關于SIRT5調節的賴氨酸丙二酰組的研究中發現，在1137個丙二酰賴氨酸鑒定位點（來自430個蛋白質）中，183個位點（來自120個蛋白質）在SIRT5 - / - KO 小鼠中比野生型小鼠中顯著增加1。具體來說，丙二酰化可調節GAPDH的活性，因此丙二酰化的鑒定對于研究代謝相關通路具有重要意義。然而，丙二酰化肽段通常很難通過質譜和CID來表征，因為這種修飾極其不穩定。

ZenoTOF 7600系統具備靈活的多重碎裂能力：碰撞誘導解離（CID）和電子活性解離（EAD），通過觀察來自GAPDH（TVDGPSGKmaLWR，K-192）中的丙酰基位點在兩種正交的碎裂模式（EAD與CID）中的碎片，可以看到使用CID碎裂模式，y離子系列碎片中活性丙二酰基團中CO2顯著的中性丟失(-44 m/z)（圖8A），然而EAD碎裂模式可生成完整的z+1離子和c離子系列碎片，在MS/MS圖譜中很容易檢測到（圖8B）2。具體來說，從z4+1到z11+1，或者包含不穩定PTM的c9和c10等碎片離子，都沒有發生顯著的中性丟失，這使得PTM位點得以明確定位。

 

圖8. TVDGPSGKmaLWR肽段在CID和EAD模式下的MS/MS譜圖。丙二酰化肽段 （m/z656.3320） 分別采用(A) CID模式和(B) EAD模式(KE=5 eV)進行分析。CID碎裂會導致-CO2(-44)的中性丟失，無法檢測到“完整的”PTM特異性區分性離子。全面的EAD解離產生了高強度的碎片離子，為直接的PTM位點定位提供了證據。
 

利用ZenoTOF 7600系統上 EAD 的動能（KE）可調節特性，可確定保留PTM修飾肽段上不穩定修飾的適合解離參數，同時實現更佳的靈敏度。KE值為5 eV時，可產生高強度、完整的 PTM 位點特異性碎片離子，同時背景噪聲很小。當KE增加到8 eV或更高時，MS/MS譜圖變得更加復雜，含有PTM修飾的碎片離子的中性丟失出現（圖9）。

圖9.  EAD動能 （KE） 值對碎裂模式的影響。 在EAD模式下分析丙二酰化肽段TVDGPSGKMALWR （m/z 656.330） 的MS / MS圖譜，其動能值分別為（A） 5 eV和（B） 8 eV。
 

7600系統中Zeno阱的應用大幅度提升了MS/MS圖譜質量和靈敏度。在激活Zeno阱和未激活Zeno阱的情況下分別采集的EAD MS/MS圖譜顯示，Zeno阱可提供明顯的靈敏度增益（圖10）。

圖10. Zeno阱激活時靈敏度提升。TVDGPSGKmaLWR肽段 （m/z 656.3320） 采用EAD模式(KE=5 eV)在(A)未激活和(B)激活Zeno阱時的MS/MS譜圖。當與EAD結合使用Zeno阱時，可觀察到信號強度和圖譜質量的顯著改善，使PTM定位更明確。
 

同樣，ZenoTOF 7600系統對于蛋白質磷酸化的分析中也提供了更多有利的信息，對磷酸化位點的定位和定量都很有幫助。CID對磷酸化肽段進行PTM位點定位及定量時，小的y離子和大的b離子往往難以檢測，此外，CID MS/MS會誘導一些不穩定磷酸化肽段上的H3PO4 （-98 m/z）的中性丟失（圖4B, D）。幸運的是，使用EAD分析能夠檢測到含有PTM的位點特異性離子，并且具有很好的信號強度，為每個肽段上的磷酸化位點提供了直接的證據（圖11A, C），對于一個序列中包含多個磷酸化位點的肽段，可以做到精確定位。
 

圖11.  EAD解離使不穩定的磷酸基團得以保存。在Skyline中提取 （A, B） LITVDGNICpSGKSK和 （C, D）  LITVDGNICSGKpSK在 （A, C）  EAD模式 (KE=2)和 （B, D） CID模式下分析的磷酸化異構體。在EAD模式下，不穩定的磷酸基團被保留。
 

參考文獻：

1.Nishida Y, Rardin MJ et al. (2015) SIRT5 regulates both cytosolic and mitochondrial protein malonylation with glycolysis as a major target. Mol Cell, 59:321-32.

2.PTM site localization and isomer differentiation of phosphorylated peptides – Tunable electron activated dissociation (EAD) MS/MS using the ZenoTOF 7600 system. SCIEX technical notr RUO-MKT-02-13174-A.

3.Qualitative flexibility combined with quantitative power. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13053-A.