光纖記錄實驗中采集不到熒光信號的可能原因及實驗注意事項
光纖記錄實驗操作較為簡便，能夠長時間穩定的動態檢測動物的神經信號，目前在神經科學研究中應用越發廣泛。但是在做光纖記錄實驗中，有時會遇到采集不到熒光信號的情況，各位小伙伴是否也曾遇到過？今天，小沃帶大家梳理一遍采集不到信號的可能原因及實驗注意事項，助你實驗更順暢！
01病毒
1.病毒是否存在反復凍融現象，反復凍融會降低病毒滴度，從而影響病毒轉染效率。因此光纖記錄實驗中，病毒應即拿即用，避免凍融。
2.病毒與目標腦區神經元特異性結合程度也會影響熒光信號。
02病毒注射
1.手術前定位：通過預實驗對腦區精準定位（可通過臺盼藍注射定位）。在病毒注射前，我們可以先注射臺盼藍進行預實驗以達到練手的目的，提高后面實驗的成功率。
腦區坐標定位參考：調平時注意左右高度差小于0.03mm。
2.病毒注射：選擇較細直徑的玻璃電極可以減少注射損傷，對于淺層腦區注射，可減少病毒泄露。病毒注射后留針10min。
3.病毒注射檢測：切腦片看熒光表達。
熒光染色實驗拍不出帶有熒光的細胞，可能原因是顯微鏡聚焦未在神經細胞這一層上（如上圖出現模糊團狀，可能會是細胞）、注射的腦區與病毒反應的特異性神經元數量太少、或是熒光淬滅掉了。
如果病毒沒注射成功，可能原因有手術中腦區定位有偏差導致病毒注射位置不對（目標腦區很小的話會常存在這個問題）、病毒注射后順著腦室流走、病毒注射后未留針導致病毒順著注射孔被析出。
03陶瓷插針埋植位置
1.病毒注射與陶瓷插針植入可以在同一個手術進行，避免二次手術對小鼠造成傷害；
2.選擇合適的夾持器，滿足不同深度及相對距離的植入手術；
3.定期查看定位儀操作臂與夾持器的固定情況，防止角度偏差。
病毒注射表達區域與陶瓷插針的植入位置需要保持接近，根據文獻中數據，超過100µm就會明顯影響信號強度。
HanQin et al., Neurophoton,2019
04耗材參數搭配
1.光纖記錄實驗對環境光比較敏感，建議實驗在光線相對穩定、昏暗的環境下進行。光纖記錄更適合選擇黑色陶瓷插針與黑色陶瓷套管，可避免環境光對熒光信號的影響；
2.較大數值孔徑的耗材有助于熒光信號的傳輸，所有的配件耗材保持相同的芯徑、NA數值更有助于實驗記錄；
3.使用高強度的激光器對光纖進行漂白，使得光纖等耗材的自發熒光降低，減少噪聲干擾。
光纖漂白器
05光纖記錄參數設置
1.首先檢查線路連接：包括光纖與機器連接的端口，光纖與小鼠連接的端口（并使用酒精擦拭光纖端口和鏡頭）。
2.調高曝光時間：Cmos相機拍攝時間增加，有助于采集到熒光信號。
注意事項：
1.若未記錄到信號，可適當調高光源功率；
2.動物腦區較大，病毒注射量可適量增加；
3.病毒注射后也可先不埋植插針，待2-3周后病毒表達，陶瓷插針連接光纖一起植入，邊植入插針邊檢測鈣信號。
瑞沃德三色多通道光纖記錄系統
產品特點：
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最大支持9通道同時采集，滿足多只動物或多個腦區位點同時實驗；
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高靈敏雙檢測器，獨立分時序采集，避免熒光串擾；
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專業集成信號采集、數據分析、行為學采集分析模塊；
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輸出信號參數自定義調節，可進行多種觸發，實現刺激和記錄的閉環控制；
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兼容光遺傳學，實現同一位點記錄和刺激。
