HEK293細胞是新藥開發研究的主要細胞，本文初步介紹了細胞的瞬時轉染技術并常用的結果分析方法：

HEK293T貼壁細胞瞬時轉染：
1. 使用 12.5 mL 培養基 將 HEK293T 細胞接種到 10 cm 板中，以在日培養后達到 70-80% 的融合度。
2. 為了提高轉染和生產過程中的細胞粘附，用無菌聚 L-賴氨酸0.01% (w/v)，75–150 kDa，細胞培養級）制備板 15 分鐘，然后用無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；137 mM NaCl、2.6 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4、1.5 mM KH 2 PO 4）。 
3. 用 10 μg 聚乙烯酰亞胺 進行轉染。將 10 μg 高質量質粒 DNA和 80 μg/mL PEI 分別稀釋在 600 μL DMEM 中。
4. 將 DNA 和 PEI 溶液混合并在室溫 (RT) 下孵育 15-30 分鐘。DNA/PEI 復合物分布在細胞上并孵育 24 小時。
5. 第二天，培養基完全被補充有 4% (v/v) IgG 剝離 FCS (PAA) 和青霉素/鏈霉素的 DMEM 替代，以較大限度地減少蛋白質 A/G 親和層析對牛 IgG 的共純化。
6. 通常每天收獲和更換培養基長達兩周。每天收獲和更換生產培養基長達 1-2 周。



在懸浮 HEK293-6E 細胞中瞬時轉染和生產
1. 在懸浮 HEK293細胞中進行瞬時生產。簡而言之，轉染前兩天 5×10 5細胞/mL HEK293-6E 在 25 至 150 mL 無血清培養基（不含 G418）中接種到 125 至 1000 mL 帶通氣膜蓋的聚碳酸酯錐形瓶中，并在 37°C 和 110 rpm 下孵育在軌道振動器中。
2. 對于小規模生產，將 12 孔板中的 1 mL/孔在線性振蕩器中以 150 rpm 的速度孵育。如果沒有另外說明，應當在 1/10 體積的新鮮無血清培養基中制備總計 1 μg 高質量質粒 DNA 和 2.5 μg PEI/mL 培養體積。
3. 量化編碼增強型綠色熒光蛋白 (EGFP) 或黃色熒光蛋白 (YFP) 變體 venus 的報告質粒 pEF-FS-EGFP 或 pCS2-venus 總 DNA 的 1/20 的轉染效率 ，分別添加。
4. 加入 DNA/PEI 復合物后，將細胞進一步培養 48 小時。然后按照其他方法與另外體積的新鮮培養基一起添加終了濃度為 0.5% (w/v) 的胰蛋白胨 N1。

蛋白 A 純化
所有scFv-hIgG1Fc 抗體和 scFv-hIgG1Fc-RNase 構建體可使用 1 mL Bio-Scale Mini UNOsphere SUPrA Cartridges 和Biorad的半自動Profinia 2.0 系統，根據標準制造商的方案通過蛋白 A 親和純化進行純化。

流式細胞儀分析
通常在轉染后 48 小時使用流式細胞儀來測量轉染效率。通過熒光 (FL) 1 中 GFP（pTTo/GFPq、NRC、BRI；總質粒 DNA 的 5%）或 YFP 的共表達來檢測轉染的細胞。用 2 μg/mL 碘化丙啶對死細胞進行染色。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( (SDS-PAGE)
SDS-PAGE 可以使用天能相關的試劑及電泳槽進行電泳分離。蛋白質標準品和樣品在還原條件下用 Laemmli 樣品緩沖液在 95°C 下制備 5 分鐘，或在非還原條件下（不含還原劑的 Laemmli 樣品緩沖液）在 65°C 下制備 10 分鐘。使用SDS-PAGE進行凝膠電泳操作。然后進行考馬斯染色。再通過 IgG/Fc 捕獲 ELISA 和凝膠光密度法定量 scFv-Fc 抗體。

通過IgG/Fc捕獲ELISA對生產上清液中的抗體進行定量的簡要步驟如下：
1. 共 100 μL/孔山羊抗人免疫球蛋白（多價）捕獲抗體（200 ng/mL）在 PBS 中稀釋并包被在 96 孔微量滴定板中在 37°C 下 1 小時。
2. 在 37°C 下用 20% (v/v) FCS 封閉 1 小時后，使用洗板器用 PBST（含 0.05% [v/v] tween-20 的 PBS）洗滌孔 3 次。
3. 在含有 1% (v/v) FCS 的 PBS 中制備總共 100 μL/孔的幾種樣品稀釋液和半稀釋系列的人 IgG 蛋白標準品，并在 37 ℃孵育 1 小時。
4. 洗滌后，將總共 100 μL/孔的 20 ng/mL 山羊抗人 IgG（Fc 特異性）抗體辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯物在室溫下孵育 1 小時。 37℃。并通過添加 100 μL/孔的 0.5 MH 2 SO 4停止。
5. 使用酶標儀在 450 nm 處針對 620 nm 的參考波長 (A 450 -A 620 )測量吸光度。此外，在無血清培養條件下在 HEK293-6E 細胞中產生的重組蛋白在考馬斯染色后通過 SDS-PAGE 進行定量。 在還原條件下制備樣品，并使用分析軟件與純化的標準蛋白質進行比較。

代謝細胞培養參數的定量測量   
用基于膜的酶分析儀對葡萄糖和 L-乳酸進行定量。同時酶標儀也可用于測量 L-谷氨酰胺與 L-谷氨酸的組合。

HEK293-6E 中的瞬時表達與優化的表達載體和分批補料工藝相結合，可提供高達 600 mg/L 重組 IgG 樣 scFv-Fc 抗體的穩健和多功能生產。  該表達系統已被證明可以在搖瓶中從毫升擴展到升體積，這可以解決高通量體外抗體生成管道的生產瓶頸。此外，與小的重組抗體片 段相比，更復雜的 IgG 樣 scFv-Fc 抗體的高效分泌生產有助于下游加工并增加與標準免疫測定和其他應用的兼容性。