導論
乳糖操縱子（ lacO）是一組埃希氏菌屬大腸桿菌基因，負責細菌中的乳糖代謝。乳糖阻遏物對它的調控是分子生物學中一個研究較為充分的系統。DNA 結合蛋白（ lacI）是控制乳糖操縱子的關鍵因子。該系統的平衡解離常數（  K_D）通常估計在 nM 范圍內。

在這篇應用筆記中我們將分享蒙特利爾大學實驗室如何使用 P4SPR 來確定 lacO / lacI 系統的結合強度（親和力， K_D）。實驗室技術人員通過易用的 P4SPR 和相應的用戶界面來開發 SPR分析，以便在本科實驗課程中演示該生物系統。
 

圖 1：乳糖操縱子與乳糖阻遏蛋白結合

實驗過程

系統設置

圖 2：臺式 P4SPR 設置

USB 供電的 P4SPR 可以連接到筆記本電腦，通過 P4SPR控制軟件啟動操作和數據記錄。易于使用的界面讓用戶可以輕松設置 P4SPR。首先，把微流體單元（圖3）蓋在金傳感器芯片上并緊密固定在傳感器芯片腔中。然后在樣品和參比通道中注入溶液以穩定基線。S形樣品通道具有 3 個平行的感應區域，其可以提供三個重復樣品的測量以及與一個參考通道的控制測量。通過透明通道可以直接觀察在通道中是否有氣泡行成，以便立即清除從而防止任何信號丟失。
 

圖 3：P4SPR 微流體單元

實驗步驟

圖 4：實驗流程圖

在達到基線穩定后，將硫醇化的 LacO DNA 注入樣品通道。形成強金-硫鍵后， 當 SPR 表面飽和后產生平臺信號。然后注射互補的 LacO 寡聚體進行雜交。在結合測定之前徹底洗滌傳感器表面。通過先前儲備的蛋白母液來制備 5, 20, 50, 100 和 200nM 的蛋白分析物溶液。依次注入逐漸增加濃度的溶液，并用大量洗滌溶液和再生緩沖液孵化 10 分鐘， 用于除去剩余的 LacI 蛋白。記錄來自所有 4 個通道的數據，然后導出到 Excel 中進行進一步的數據分析。

結果和討論
在該實驗中，從樣品通道得到 3 條平行結合曲線。對該信號進行平均后，從參考通道信號中減去來得到 SPR 信號相對于時間的信號圖（圖 5）。使用不同濃度的結合位移來建立結合等溫線，從而確定 K_D（圖 6）。計算的  K_D為 6.4± 1.2nM，符合相關低濃度基于 LacI 的轉錄抑制蛋白的文獻報道值¹。值得注意的是，與已發表論文中使用的 DNA 結合分析相比， SPR 分析不需要任何 DNA 放射性標記，并且可實時監測。

圖 5：關于不同濃度的 LacO 隨時間變化的 SPR 信號
 

圖 6：疊加 Lacl 濃度增加的結合曲線

P4SPR 優勢
P4SPR 獨特的模塊式， 便攜和多通道設計使其成為用于藥物發現，生物/傳感和系統集成應用的靈活臺式 SPR工具。它幾乎不需要樣品制備，使得系統設置快速簡單，同時節省了用戶在純化試劑盒和試劑上的成本。此外， P4SPR 利用薄膜 SPR 的高靈敏度和更深的穿透深度來準確測量結合的親和力。

總結
P4SPR 成功地檢測乳糖操縱子 DNA 與其阻遏蛋白的結合相互作用，并且數據可通過之前發表的文獻驗證。本科生可從該實驗熟悉 SPR 技術及其在監測生物分子相互作用中的應用。此外， P4SPR 系統也可研究其他生物系統，如 DNA-DNA， RNA 以及適體對，可以幫助科研人員更好地了解結合作用并揭示其在生物系統中的功能。

致謝
我們要感謝 Philipe Lampron， Shona Teijeiro 和蒙特利爾生物化學大學的 Sébastien Truche 開發該技術。

關于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 是一個從蒙特利爾大學衍生的企業。Affinité Instruments 的創始人在 SPR 領域積累了十多年豐富的研究經驗，并通過多元化的商業，科學和工程領域經驗將創新的 SPR技術商業化。

¹Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities ofengineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation.

doi: https://doi.org/10.1101/477893