目前蛋白降解劑研發中PROTAC和分子膠臨床進展領先，作用機制相對明確。PROTAC作用機制是“事件驅動”的催化反應，催化靶蛋白降解后，即可釋放出來參與下一個蛋白的降解。與傳統小分子抑制劑相比，可大幅降低給藥濃度。PROTAC即使經過藥物代謝在體內清除，細胞仍需要較長時間將靶蛋白恢復到發揮生理作用水平，所以PROTAC有望延長藥物作用時間。

 

GSK公司臨床前研究初步展示，一款靶向RIPK2的PROTAC， 血藥濃度降到很低時，體內RIPK2蛋白濃度仍維持在較低水平，炎癥因子維持較高抑制水平，這可能實現低頻次給藥。同時，PROTAC在藥物濃度優化有“hook effect”。這些因素都導致傳統方法不能準確評估PROTAC的PK/PD特性，需建立新的PK/PD評估系統。

 

建立新PK/PD評估系統需要檢測技術準確定量藥物濃度和蛋白質降解水平關系，及相關生物標志物變化，從而建立PK/PD作用關系。

 

 

實驗模型上需要更多研究和設計，在固定給藥時間后取樣檢測藥物濃度變化與活性關系，動物水平藥物作用后相關信號通路蛋白調節、還有生物標志物選擇和檢測，要求要有可靠方法檢測動物模型的內源性蛋白表達。

 

目前有多種蛋白質表達檢測方法可用于體內實驗和臨床組織樣本研究。液質聯用技術，可特異性高靈敏檢測組織樣本中蛋白質，用于臨床前和臨床樣本，但其缺點是樣本前處理復雜，樣本需求量大。流式細胞術可檢測細胞內和細胞膜蛋白，特別是細胞膜蛋白，對血液中免疫細胞檢測有優勢，同時進行細胞分類和蛋白定量。免疫組化或免疫熒光技術，主要用于組織蛋白定位和半定量。ELISA技術主要用于檢測分泌型細胞因子和趨化因子。Western blot技術可視化看到靶蛋白降解，但傳統western只能半定量，手動操作多，重復性差，時間長，樣本需要量大，不能很好滿足PROTAC體內精確蛋白定量需求。Digital Western作為一種新型的毛細管電泳免疫學檢測技術，可滿足臨床前到臨床樣本檢測需求，實現從臨床前到臨床方法轉移，是新一代蛋白質表達標志物檢測技術。

 

 

行業領先公司采用Digital Western Blot（也稱為Simple Western系統）案例分析

 

1.  輝瑞公司利用Digital WB分析PROTAC大鼠體內降解組織選擇性

 

輝瑞公司發表在PNAS上文章，主要研究不同linker長度對蛋白降解活性和組織選擇性的影響。

 

 

• 10只大鼠分5組皮下給藥PROTAC 10，藥物濃度遞增；175mg/kg兩次給藥。脾臟和肺臟內BTK蛋白濃度變化。B圖是原始數據，絕對化學發光數據值變化。

• 盡管不同濃度化合物具有相似組織吸收度和和血漿利用度(D和E), PROTAC 10對大鼠脾臟細胞BTK具有濃度依賴性降解，但對于臟沒有，顯示出化合物組織選擇性；采用質譜蛋白質組量化脾臟和肺中BTK豐度獲得相似結果。

• 組織選擇性機制可能與BTK或E3連接酶表達、泛素化過程。研究體內控制蛋白降解因素，需要深入理解PK/PD關系。

• 本研究展示開發一種Digital WB技術檢測BTK靶蛋白表達方法，可用于細胞系和動物組織樣本靶蛋白檢測，適用于In vitro到In vivo不同階段實驗需求，方法通用性高。

 

2.  Digital Western開發多發性骨髓瘤臨床樣本中蛋白質表達評估，檢測63名患者10多種蛋白表達，包括CRBN和IKZF1蛋白表達，分析蛋白質標志物在多發性骨髓瘤患者預后影響，作為預測性生物標志物價值。

 

3.   Arvinas中樞神經系統疾病Tau-PROTAC體內研究案例

 

中樞神經系統疾病是PROTAC研究的主要領域，具有多個研發管線在進行。目前神經疾病體內實驗經常需要測試腦組織樣本，樣本具有珍稀特性，以Tau為例，具有多種翻譯后修飾，特別是各種磷酸化修飾，導致采用傳統Western blot技術具有多個條帶，實驗條件復雜，很難準確定量，在組織水平檢測這些致病蛋白具有更高的挑戰。

 

 

Arvinas公司建立了針對神經系統疾病一體化研發平臺，基于現有致病蛋白研究成果，構建了早期發現平臺，利用DEL、AI技術和對E3連接酶理解，開發PROTAC分子。構建了PK/PD體內研究模型，來支持臨床轉化開發。其Tau-PROTAC項目可區分健康和病理Tau蛋白，具有技術優勢。而抗體藥物只能阻斷細胞外病理Tau，ASO等基因編輯技術，不能區分健康和病理狀態Tau蛋白。本項目預期2022年可能臨床獲批IND。本項目利用Digital Western檢測體外細胞水平不溶性Tau蛋白降解水平，同時也檢測體內PD/PD實驗檢測不溶性Tau降解水平。

 

 

4.  急性髓系白血病（AML）臨床試驗樣本磷酸化蛋白定量分析

 

Onvansertib濃度依賴性降低pTCTP表達，在血漿中有抑制活性。部分病人中觀察到在循環異常細胞PLK1靶標TCTP參與。骨髓異常細胞減少與PLK1靶標TCTP參與相關，可能作為療效評估的生物標志物。Digital WB技術滿足小分子藥物臨床樣本檢測需求，采用洗脫重雜交Replex技術，或者高靈敏雙色熒光Western可評估磷酸化蛋白表達，用于PD實驗和生物標志物檢測。

 

A和B是患者血漿樣本與HL-60細胞共孵育，進行血漿抑制活性實驗。Digital WB定量分析血漿樣本中pTCTP水平變化；

B圖不同Onvansertib藥物濃度下pTCTP抑制水平。高濃度時抑制水平增加；

C圖是病人PBMC樣本TCTP和磷酸化TCTP蛋白表達檢測實驗。第一天給藥前后0h和3h結果，上面target engagement病人（ ≥50% pTCTP 抑制 ），下面是nontarget engagement病人。12，27和40三個劑量不同患者數據；

D圖是骨髓異常細胞群相對于基線的百分比變化瀑布圖。

 

Digital Western技術

在PROTAC體內降解實驗價值

 

檢測微量珍貴動物組織樣本如腦組織或肌肉組織等，實現靶蛋白和細胞信號通路蛋白質標志物定量檢測。將在體內PD/PK和藥理學實驗中發揮重要作用，加快藥物研發。

自動化標準化：Digital Western快速獲得高質量重復性數據，數據合規，軟件符合FDA CFR Part 11要求，可滿足臨床實驗技術要求。已被用于小分子藥物臨床實驗和基因治療臨床試驗中蛋白質標志物檢測。

技術適用于藥物研發臨床前和臨床不同階段檢測需求，開發一種方法滿足不同場景下生物分析需求，從藥物發現階段In vitro細胞水平系實驗、到動物體內PK/PD實驗、Ex Vivo實驗，一直到藥物臨床試驗中病人活檢組織樣本。

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參考文獻

1. Mares, A., Miah, A.H., Smith, I.E.D. et al. Extended pharmacodynamic responses observed upon PROTAC-mediated degradation of RIPK2. Commun Biol 3, 140 (2020).

2. Watt GF, et al. Targeted protein degradation in vivo with Proteolysis Targeting Chimeras: Current status and future considerations, Drug Discov Today: Technol (2019)

3. Derek W. Bartlett and Adam M. Gilbert. Translational PK–PD for targeted protein degradation.Chem. Soc. Rev., 2022,51, 3477

4. Adelajda Zorba, etc. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. PNAS, July 16.2018

5. https://s3.us-east-1.amazonaws.com/arvinas-assets.investeddigital.com/scientific-publications/Angela-Cacace-AAIC-July-2021_2021-08-06-014821_rskj.pdf