使用RT-PCR法檢測鼻咽樣品中的新冠病毒

瀏覽次數：2063　發布日期：2023-1-6　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

一、PCR：

PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis發明，至今仍廣泛使用的DNA擴增技術。它通過高溫解鏈、低溫退火、中溫擴增的過程，來實現目標片段DNA的指數級擴增。

PCR反應體系可以簡單概括為：DNA模板（Template）、引物（Primer）、DNA聚合酶（Polymerase）、三磷酸核苷（dNTPs）及緩沖液。緩沖液中常含氯化鎂等金屬鹽，并可能添加BSA、DTT、甲酰胺等助于聚合酶活性和模板解鏈的試劑，并以PreMix、MasterMix的形式商品化，耐思通用型核酸擴增試劑盒可滿足常規PCR需求。

PCR熱循環儀是實現PCR反應的外部硬件，通過程序化的溫度控制，利用金屬浴來按時加熱、冷卻PCR反應體系。DNA雙鏈模板中的氫鍵在高溫下斷裂；溫度降低后，體系中互補引物與模板單鏈重新形成氫鍵結合，從而產生粘性末端。DNA聚合酶辨識粘性末端結合后，在中等溫度下以dNTP為原料在引物后延長DNA鏈。如此產生的DNA鏈在新的一輪循環中可以作為額外的模板重復擴增反應，若干循環后目標DNA片段便實現指數級擴增。

實驗案例：一個經典的實驗室PCR實驗

PCR體系的組成：DNA模板（<100ng）、上下游引物（2mM）、dNTPs（2mM）、DNA聚合酶MasterMix（2X）。PCR體系常為20μL或50μL的體積，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。一個典型的PCR程序如下：

二、qPCR、RT-PCR、數字PCR：

傳統PCR技術僅在終點處檢測產物，因此也叫終點PCR（End-point PCR），常用于克隆、測序及基因分型等。而與之相對應的，在整個反應中都檢測目標序列熒光信號的技術稱為實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR），簡稱qPCR。qPCR的檢測能力、應用范圍相對于終點PCR都有很大的提高。

qPCR中有嵌入或基于探針的熒光染料在循環中實時反應產物濃度。一系列從低到高濃度的DNA模板參照會與目標模板同步擴增，較高濃度的DNA模板在擴增過程中會更快達到檢測閾值，而擁有較小的CT值（Cycle Threshold）。反應結束后通過繪制對照DNA模板濃度與CT值的標準曲線即可計算目標模板初始的濃度，實現樣品中DNA定量的目的。qPCR的應用包括單核苷酸多態性（SNP）檢測、基因診斷、腫瘤載量及治療效率檢測等。

基于qPCR的RNA定量技術稱為逆轉錄PCR（Reverse Transcriptase PCR），寫為RT-PCR。（由于“實時”與“逆轉錄”的英文縮寫均為RT，為避免混淆，通常“實時”小寫為rt，“逆轉錄”大寫為RT。）RT-PCR通過逆轉錄RNA形成互補DNA（Complementary DNA，cDNA）后以cDNA作為模板進行PCR擴增，可以應用于基因表達分析、病毒載量檢測等。

模擬實驗：標準RT-PCR法檢測鼻咽樣品中的新冠病毒

檢測新冠病毒的引物和檢測探針序列設計可以圍繞包膜（Envelope，E）、核衣殼（Nucleocapsid，N）、RNA聚合酶（RdRp）或復制酶基因（ORF1ab），其中N和ORF1ab的序列在中國疾控中心的網站上有公開。

1. 使用鼻咽拭子在鼻粘膜或咽部采樣，置于2mL病毒轉移液（VTM）采樣管中

2. 取采樣后的樣品液200μL使用RNA提取試劑盒提取樣品，大量樣品可以使用磁珠法病原微生物基因組核酸提取試劑盒及配套儀器自動提取。

3. 使用2.5×RT-qPCR預混液(多重-探針法）試劑盒中的預混液（10μL）與引物、探針（5μL）和提取樣品（10μL）配置25μL反應體系，同步準備用于繪制標準曲線的參照體系。

4. 熱循環儀的程序可大致設定為55℃ 5min逆轉錄，95℃ 5min預變性，45個擴增循環：95℃ 5sec、60℃ 15sec、72℃ 15sec。進行RT-PCR反應。

5. 最后用標準曲線計算樣品中RNA模板的濃度，參照CT值標準判斷是否陽性。

數字PCR（Digital PCR，dPCR）是基于終點PCR與qPCR發展而來的第三代核酸擴增技術，利用統計學方法實現核酸分子的絕對定量。數字PCR可以理解為將一個終點PCR體系分散成數以萬計的微PCR反應，每個微系統體積為納米級，且理論上僅含若干個、1或0個目標核酸分子。在熱循環反應完畢后，用熒光檢測系統記錄微流控芯片上每個微系統的擴增情況，最后以泊松分布模型來計算初始體系中核酸分子的數量，可謂是生物分子檢測與統計學的完美結合。dPCR已被廣泛應用于臨床診斷、轉基因成分定量、單細胞基因表達、環境微生物檢測等領域。

附：可使用到的耐思產品