導(dǎo)讀

在新型冠狀病毒感染咳嗽的診斷與治療專家共識(shí)（2023，46）中針對(duì)咳黃膿痰或外周血白細(xì)胞增高提示可能存在細(xì)菌感染，在2021年發(fā)表的95例COVID-19患者合并細(xì)菌及真菌感染的臨床分析中，結(jié)果表明，COVID-19危重型患者易合并鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌等細(xì)菌和真菌的感染，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，是一類重要的醫(yī)源性感染革蘭氏陰性條件致病菌，對(duì)多數(shù)抗菌藥物易產(chǎn)生耐藥性，占臨床分離菌的13%，成為僅次于大腸埃希菌 (19%)的院內(nèi)感染第二大致病菌。

上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國重實(shí)驗(yàn)室科學(xué)家基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)建立了肺炎克雷伯菌的數(shù)字PCR檢測(cè)方法。數(shù)字PCR檢測(cè)靈敏度最低檢出限可達(dá)到3.37copies/μL；方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)均小于25%；本研究利用優(yōu)化后的數(shù)字PCR方法共檢測(cè)了28 株臨床菌株，檢測(cè)到14株為肺炎克雷伯菌，14株為其他種屬，該方法特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高，適合肺炎克雷伯菌的核酸檢測(cè)和定量分析，也為其他臨床病原菌的分子檢測(cè)提供了新的技術(shù)參考。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  數(shù)字PCR (digital PCR，dPCR)作為第3代 PCR技術(shù)，具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、精確度高的特點(diǎn)，可檢出微量的細(xì)菌核酸分子。

▶ 與傳統(tǒng)的qPCR 相比，dPCR不受擴(kuò)增效率的影響，無需依賴擴(kuò)增曲線、無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行絕對(duì)定量，同時(shí)對(duì)低濃度的核酸定量更加準(zhǔn)確可靠。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

１、通過數(shù)字PCR的檢測(cè)范圍和靈敏性實(shí)驗(yàn)得到，cdPCR樣品后續(xù)可在S5−S9樣本檢測(cè)范圍內(nèi)進(jìn)行。

▲圖１.數(shù)字PCR對(duì)不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度測(cè)試結(jié)果。
藍(lán)色：陽性微滴；灰色：陰性微滴；NTC：陰性對(duì)照

２、數(shù)字PCR與熒光定量PCR的檢出范圍和靈敏性實(shí)驗(yàn)，得到cdPCR對(duì)低濃度樣品的檢測(cè)更準(zhǔn)確。此外，cdPCR的最低檢出限(3.37copies/μL)，較qPCR (194.9 copies/μL) 有更高的檢測(cè)靈敏度。

▲圖2: pUC57-16S的數(shù)字PCR (A)和熒光定量PCR (B)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 2B不同稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的Ct值：S1：9.84；S2：12.89；S3：16.21；S4：19.74；S5：22.34；S6：25.69；S7：28.11；S8：32.56；S9：35.42

３、同時(shí)對(duì)3株肺炎克雷伯菌和4株其他菌株進(jìn)行特異性評(píng)估驗(yàn)證，cdPCR方法對(duì)肺炎克雷伯菌的特異性檢測(cè)有效。

4、利用cdPCR對(duì)28株臨床菌株進(jìn)行檢測(cè)，有14株菌為肺炎克雷伯菌，14株為其他菌株，說明cdPCR具有臨床菌株檢測(cè)應(yīng)用潛力。

綜上所述，本研究建立了檢測(cè)肺炎克雷伯菌的數(shù)字PCR方法。與qPCR技術(shù)相比，cdPCR可以精準(zhǔn)地對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量分析，檢測(cè)下限低至單拷貝，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線， 具有較好的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，在稀有樣品或痕量樣品的檢測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，該方法為提高肺炎克雷伯菌的早期核酸檢測(cè)提供了新方法，也為核酸絕對(duì)定量提供了新的數(shù)據(jù)支持。

同時(shí)naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)為新冠病毒合并細(xì)菌感染的多重檢測(cè)提供可能。

naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。