來自Merck

 

溶瘤病毒（Oncolytic virus）療法是一種新型免疫療法，基于病毒在腫瘤中的感染和復制來殺死腫瘤細胞，并增強適應性免疫。該療法通常使用的病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒和柯薩奇病毒（Coxsackievirus）。

 

2022年，Merck發表兩篇文章利用全自動毛細Digital Western技術定量表征柯薩奇病毒（Coxsackievirus A21 ，CVA21） VP1、VP2、VP3、VP4和VP0，并探究純化工藝對病毒顆粒影響。

 

 

柯薩奇病毒

CVA21是一種腸病毒，基因組為單鏈RNA（~7.4 kb），其衣殼是由60個蛋白亞基所組成的二十面體，直徑為30 nm。

CVA21示意圖片

 

CVA21絞殺癌癥細胞機制是通過與癌細胞表面過表達受體（Intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1），即細胞間黏附分子-1相結合，上調其表達。ICAM-1在控制腫瘤惡化和轉移的過程中起重要作用。CVA21的臨床研究顯示了其良好的安全性和靶向腫瘤細胞死亡的特性。

 

快速、準確及可量化表征病毒載體空/完整/部分完整的衣殼對于細胞培養、工藝開發、滿足監管要求和驗證生產過程至關重要。

 

 

鑒定表征

 

成熟病毒（Mature virion/Full particle）含有 VP1、VP2、VP3和VP4。未成熟病毒（Immature virion/Empty particle）僅含有VP0、VP1和VP3。

 

已組裝的CVA21衣殼由原體（Protomer）和五聚體（Pentamer）組成。原體由VP1、VP3和前體蛋白（Precursor protein）VP0組成。5個原體組成一個五聚體。12個五聚體可組裝成缺少RNA基因組的空殼顆粒（Procapsid/Immature virion），或者包含病毒RNA基因組前病毒體（Provirion），當VP0分裂成為VP4和VP2后形成成熟病毒（Mature virion）。

 

VP1代表總顆粒含量；VP4代表完整衣殼病毒；VP0代表未成熟病毒/空衣殼。通過VP0和VP4，可表征空殼與完整衣殼的相對比率。通過VP0和VP1，可表征空殼與完整衣殼的絕對比率。

 

CVA21原料藥（DS）和藥物產品（DP）的生產涉及多個單元操作，需在整個過程中表征總顆粒濃度以及空顆粒與完整顆粒的比率。在產品開發過程中，總顆粒濃度被用來量化細胞培養和下游純化過程中產生的病毒顆粒的質量產量。只含有VP1、VP3和VP0（37.2 kDa）的非感染空殼顆粒被認為是與產品相關的雜質，其中大部分必須被去除。因此，DS和DP須被純化為主要包含具有感染性的、成熟的、完整的顆粒，即由VP1、VP2、VP3和VP4組成，理論分子量（MW）分別為33.2 kDa、29.9 kDa、26.5 kDa和7.3 kDa。

 

文獻已有報道使用如下幾種方法表征非包膜病毒衣殼，如腺相關病毒（AAV）。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和高壓排阻色譜（HPSEC）已被用于測定總AAV顆粒。同樣，冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）、離子交換色譜（IEX）、分析型超速離心（AUC）、毛細管等電聚焦（cIEF）和質譜（MS）也已被用于表征完整與空AAV顆粒。類似的方法已被用于表征柯薩奇病毒A16。但是，定量表征CVA21蛋白和病毒顆粒的分析方法十分有限。研究人員曾使用高壓排阻色譜/多角度光散射/折射（HPSEC/MALS/RI）定量總病毒顆粒，使用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）表征空殼率。但是，這兩種方法不能在細胞培養收獲樣品和未純化的中間體中進行，因為會受到培養基和宿主細胞碎片干擾。

 

 

Merck評價

自首次引入毛細管Western Blot技術（即全自動毛細管Digital Western技術，也被稱為Simple Western）及其在疫苗應用中首次報道，該技術已成一種非常實用且重要的分析疫苗產品的工具，包括鑒定、濃度、酶動力學、穩定性和試劑篩選。

 

Merck研究人員指出，全自動毛細管Digital Western技術（Simple Western）是寶貴的分析工具，該技術可提供及時信息幫助指導下游工藝決策和優化。并且，該技術擁有更廣泛的溶瘤病毒應用拓展，以及基因治療領域中AAV相關應用。

 

 

結果展示

圖1：全自動毛細Digital Western（Simple Western）表征CVA21 VP0、VP1、VP2、VP3和VP4；

 

圖2：全自動毛細Digital Western（Simple Western）絕對定量VP0，即未成熟病毒/空衣殼；

 

圖3：不同純化步驟（Purification step, PS）后表征VP0和VP4；

 

Digital Western技術加速基因治療

一站式探索多個關鍵質量屬性

全自動毛細管Digital Western技術作為創新性毛細管電泳免疫學技術，此技術已被基因治療和核酸藥物領域領導者廣泛采用，如Ionis Pharmaceuticals、Sarepta、pfizer、Regenxbio、Arcturus、MeiraGTx、Editas medicine、CRISPR Therapeutics、Alnylam、Dicerna、Arrowhead、Moderna、BioNtech、杭州嘉因生物、石藥集團等。

 

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參考文獻：

1. Andrew R. Swartz, et al. “Binding of Coxsackievirus A21 procapsids to immobilized glutathione depends on cell culture conditions during infection,” Virology, Volume 573, 2022.

2. Gillespie, Paul F et al. “Quantitation of Coxsackievirus A21 Viral Proteins in Mixtures of Empty and Full Capsids using Capillary Western.” Human gene therapy, 2022.

3. Chuan Xiao, et al. “The Crystal Structure of Coxsackievirus A21 and Its Interaction with ICAM-1,” Structure, Volume 13, Issue 7, 2005.