細胞計數是細胞培養過程中的重要步驟，“金標準細胞計數方法”是在顯微鏡下使用血細胞計數板人工計數。這里博大博聚為大家介紹下金標準細胞計數的詳細的步驟，供大家參考。

1、準備好血細胞計數板
1)     先用無水乙醇清潔血細胞計數板表面和蓋玻片；
2)     再用純水清潔血細胞計數板表面和蓋玻片；
3)     每次清洗后用洗耳球吹干。
4)     在血細胞計數板的計數池上方蓋上專用的蓋玻片。
注意：最好不要擦拭血細胞計數板的計數池，防止標識線損壞。

2、制備細胞懸液
1)     貼壁生長的細胞，使用胰酶消化的方法使細胞從培養瓶表面脫落；
2)     漩渦混勻或使用移液器反復吹吸細胞懸液，盡量減少細胞團簇；
3)     懸浮細胞則可以直接進行取樣計數；
4)     細胞懸液的計數濃度：5×10⁵個細胞/m L -5×10⁶個細胞/m L。

注意：
a)      盡量少、盡量小的細胞團簇；
b)     如需計算活率，則需將細胞懸液按照1：1的比例加入等量的0.4%的臺盼藍染料，混勻后，靜置1~2分鐘。   

3、細胞加樣
1)     移液器輕吹細胞懸液使其混合均勻；
2)     將細胞懸液與臺盼藍染料按1:1體積混合均勻；
3)     取出10uL細胞懸液，將細胞懸液滴加于血細胞計數板邊緣凹槽處，此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池。
 

注意：                                             
1)     每次加樣前要混勻細胞懸液，防止細胞沉降造成取樣誤差增大；
2)     加樣過程中，要一次性將細胞懸液注入計數室，防止氣泡產生，否則要重做；
3)     加樣時不要將細胞懸液直接吹入計數池，會造成細胞分布不均勻。

4、 人工細胞計數
計數工具：10X物鏡的顯微鏡、血細胞計數板。
1)     加樣后，將血細胞計數板靜置數分鐘；
2)     把血細胞計數板放置在顯微鏡的載物臺進行觀察-計數-記錄；
3)     分別計數大方格1-2-3-4中的細胞總數。
 

注意：
1)     計數時建議重復1-2次，取平均值，減小計數誤差；
2)     四個區域的細胞數量偏差不應超過 5%，否則要重新加樣。
3)     對橫跨刻度上的細胞，依照“數上不數下，數左不數右”的原則進行計數。
4)     為降低細胞計數誤差，濃度最好控制在5×10⁵個細胞/ml以上（每個大方格有50個以上細胞）；
5)     計數時，只計數完整的細胞，如有聚團細胞則按一個細胞進行計數。

5、 血細胞計數板濃度計數標準
（中國的標準：JJG 552-1988血細胞計數板試行檢定規程）
 

1)     如上圖所示，當血細胞計數板放上蓋玻片后，平臺與蓋玻片之間的距離 (即高度)為 0.1mm；
2)     平臺中心部分各以3mm長，3mm寬精確劃分為9個大方格，稱為計數室，每個大方格面積為1mm²，體積為 0.1mm³；
3)     細胞濃度 (mL)=(四個大方格細胞數之和)/4X2（染液稀釋倍數）X 10⁴⁼？個細胞/mL。

注意：如果不加入臺盼藍染料，則無需乘以2。
相信有些小伙伴，即使花費很長時間熟悉，并實際接觸細胞計數操作的全部流程后，還是會有結果不滿意、人工操作效率低、結果無法一目了然、細胞計數數到“眼疼”的情況。

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7、血細胞計數板上機實拍圖案例

8、細胞計數結果包括
總細胞濃度、活/死細胞濃度、活/死細胞比率、總細胞聚團率/濃度、活細胞聚團率/濃度、死細胞聚團率/濃度等計數結果、原始圖片、識別圖片、柱狀圖、散點圖、等高線圖、報告單等…

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