一、貼壁細胞的傳代所需材料

· 裝有貼壁細胞的培養容器

· 經過組織培養處理的培養瓶、培養板或培養皿

· 完全生長培養基，預熱至 37℃

· 一次性無菌15ml試管

· 37℃ 培養箱，充有二氧化碳濃度為 5% 的濕化空氣

· 平衡鹽溶液，例如：杜爾貝科磷酸鹽緩沖液 (DPBS)，不含鈣、鎂和酚紅

· 消化酶，例如：胰蛋白酶，不含酚紅

二、貼壁細胞傳代流程

細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風30min，操作前需要換細胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

1. 取對數生長期的貼壁細胞，棄掉舊培養基。

2. 用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞1-2遍。 (每10 cm2 培養表面積需要2 ml 溶液)。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數次。

注：沖洗步驟可去除可能抑制消化酶作用的少量血清、鈣和鎂。

3. 從培養容器中吸出沖洗液并丟棄。

4. 向培養瓶中加入預熱的消化酶(例如：胰蛋白酶)；試劑量應足以覆蓋細胞層 (每10 cm2 大約0.5ml)。輕輕搖晃容器，使試劑完全覆蓋細胞層。

5. 將培養容器在室溫下孵育約2分鐘。

請注意，實際孵育時間根據所用細胞系不同可能有所差異。

6. 在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達90%，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養容器以加快細胞解離。

7. 細胞解離程度大于等于90%時，傾斜培養容器，使細胞上液體盡快流盡。加入所用消化酶兩倍體積的預熱完全生長培養基。輕柔吹打細胞層表面數次，使細胞分散，成為單細胞懸液。

8. 將細胞轉移到 15ml 離心管中，200g 離心5至10分鐘。

請注意，離心速度和時間依細胞種類不同而有所差異。

9. 用最少體積的預熱完全生長培養基重新懸浮細胞沉淀。

注：此時可進行細胞計數

10.將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細胞懸液轉移到新的細胞培養容器中，把細胞放回培養箱。

注：如果使用培養瓶，將其放入培養箱前應將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養瓶和透氣性瓶蓋。

三、懸浮細胞的傳代

懸浮細胞傳代比貼壁細胞傳代稍微簡單一些。由于細胞已經在生長培養基中懸浮，因此無需通過酶的作用使其從培養容器表面脫離，整個過程較為迅速，對細胞的損傷也較小。懸浮生長細胞的傳代培養要比貼壁細胞簡單得多，通常有兩種方法。

1．直接給帶傳代的培養瓶中補充一定量的新鮮培養基，然后將進行分裝。

2．先通過離心棄掉營養匱乏的舊培養基，然后再用適量的新鮮培養基重懸細胞沉淀，最后將其分裝至培養瓶中即可。

懸浮細胞傳代后的延滯期一般比貼壁細胞短。

四、所需材料

• 裝有懸浮細胞的培養容器

• 完全生長培養基，預熱至37℃

• 37℃培養箱，充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣

五、懸浮細胞傳代流程

所有與細胞接觸的溶液和設備均應為無菌狀態。必須采用正確的無菌技術，并且在超凈臺內進行。傳代應在細胞處于對數期、未達到匯合狀態時進行。達到匯合狀態時，懸浮培養的細胞會聚集成團塊，轉動培養瓶時培養基會變得渾濁。傳代前所建議的最大細胞密度隨細胞系不同而有所差異；詳細信息請參閱針對具體細胞的產品說明書或操作手冊。

六、懸浮細胞的傳代方法有2種

1、直接傳代法：

①待懸浮細胞長滿至80%-90%左右（細胞懸液變黃），即可傳代；

②用吸管吸棄細胞懸液1/2～2/3；

③加入適量的新鮮培養基，繼續培養。

2、離心傳代法：

①將細胞懸液轉移到離心管內；

②150g離心5min，棄上清；

③使用新鮮的培養基重懸細胞；

④吸管吸取適量細胞懸液，裝入新的培養瓶，再加入適量的新鮮培養基，繼續培養。