Genentech團隊篩選出新生抗原-HLA結合表位
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T細胞在消除癌細胞方面發揮著關鍵作用1,2，增強內源性腫瘤特異性T細胞活性(例如癌癥疫苗)或引入靶向新抗原的T細胞的免疫療法具有很好的臨床療效3,4。新抗原導向的治療方法需要腫瘤細胞表面具有可被HLA呈遞的新抗原表位，即由突變蛋白衍生的8 – 11個氨基酸多肽。T細胞受體(TCRs)在HLA復合物的背景下與同源肽相互作用，使得治療靶點既可以是新抗原表位序列又可以針對不同HLA的分型。盡管臨床前景看好，但新抗原特異性治療的應用仍受到限制，尤其是可能是某些癌癥亞型的患者中共有的那些，被驗證新抗原表位與HLA的結合的范圍是有限的。
1.高通量TR-FRET測定和NetMHCpan-4.0預測結合用于共有新抗原-HLA結合表位的發掘
圖1 高通量篩選新抗原表位的工作流程
2.構建穩定表達47種癌癥共有新生抗原的I型HLA單等位基因細胞系
選擇HMy2.C1R (C1R) 淋巴母細胞，利用CRISPER-Cas9破壞其HLA-C等位基因(HLA-C*04:01)，生成HLA-null細胞群，并通過FACS將目標細胞群富集出來。隨后，通過穩定的慢病毒轉導將15個HLA等位基因作為單個轉基因分別引入新抗原連接子表達和非連接子表達的C1R-HLAnull細胞系，最終共獲得30個細胞群。連接子和無連接子的新抗原工程細胞構建時包含了一組相同的7個已知的HLA-A*02:01遞呈表位。并且，隨后的HLA-IP和靶向質譜分析證實了連接子和非連接子HLA-A*02:01工程細胞中存在的兩種對照肽和前序報道的TP53 R175H23新抗原表位。
圖2 單等位基因工程細胞系的構建
3.利用質譜技術鑒定單等位基因工程T細胞中的免疫多肽組
4.PRM靶向驗證候選結合表位
首先通過TR-FRET RZ評分≥5初步篩選出397條多肽，然后結合NetMHC %Rank≤2和RZ評分< 5篩選出互補的81條，共計對479條候選的新抗原多肽進行合成，然后通過PRM進行靶向鑒定。結果共篩選出86個新抗原表位-HLA結合對和36條新生抗原肽。86個結合對中，有21個是已發表過的，65個是未曾報道的新發現，共55個被TR-FRET與NetMHC預測均認定為預測結合位點。另外，通過與非靶向質譜數據相比，靶向法能更好地識別出結合能力較弱的新表位，且能實現絕對定量。
5.全長蛋白的KRAS新抗原表位驗證
為了驗證由全長突變蛋白加工生成的新生抗原肽，構建了4個HLA-A*11:01單等位基因突變的C1R細胞系，包括全長野生型、G12C、G12D或G12V突變的KRAS，并通過全細胞靶向蛋白組驗證各自的信號肽。然后，將先前鑒定到的與HLA-1*11:01相關的兩個KRAS表位進行富集和靶向定量。與全長野生型細胞系相比，G12V和G12D的均被明顯誘導產生更多VVVGAVGVGK的結合表位。最后，在內源性表達相關蛋白和HLA的細胞系中，進一步驗證了發現的候選新抗原結合表位。
6.腫瘤特異性抗原-HLA結合對的功能驗證
采用了復合TCR發現法進一步驗證了通過該方案篩選出的新抗原表位可以被人的T細胞識別。以鑒定到的兩個新表位-HLA結合對(FLT3-p.D835Y/A*02:01, PIK3CA-p.E545K/A*11:01))為例，首先將新表位以獨特的組合分配到多肽庫中，然后使用自體單核細胞來源的樹突細胞對健康人供體CD8+ T細胞進行擴增，接著用新表位肽庫重新激活T細胞，再通過激活標志物排序，最后進行TCRβ測序。結果發現，與野生型相比，PIK3CA-p.E545K TCR能夠特異性識別突變的PIK3CA，并且有可能是潛在的治療靶點。
圖6 篩查新抗原-HLA結合對的特異性TCR以驗證免疫原性
綜上所述，本研究創建了一個可擴展的新抗原表位- HLA結合對的發現策略。首先選擇了47個癌癥突變和15個HLA等位基因來定義新抗原表位，并由此擴展到假定的臨床靶點。然后，采用高通量HLA結合測定法5.6和NetMHCpan-4.07，在濕實驗和計算預測兩個方面對新抗原-HLA結合對進行篩選。針對上述方法觀察到的新抗原-HLA結合對，分別采用非靶向和靶向質譜法(MS)對HLA單等位細胞系的免疫多肽組進行分析，最終得到86個新抗原-HLA結合對。為了評估這些靶點的治療潛力，通過TCR證明了突變選擇性T細胞對有這些新抗原表達的細胞的靶向殺傷力。
目前在PEAKS的軟件中，針對多肽組分析，尤其是以免疫多肽為代表的應用場景，我們已經推出基于深度學習技術的DeepNovo Peptidome工作流，原有PEAKS de novo+ PEAKS DB的分析基礎上，通過氨基酸水平的置信度、保留時間和CCS值等預測，特別是巧妙地通過兩輪分析將從頭測序的多肽結果納入全局FDR的質控，對于多肽組鑒定的靈敏度和準確度進一步提高。
參考文獻：
1.Jhunjhunwala, S., Hammer, C. & Delamarre, L. Antigen presentation in cancer: insights into tumour immunogenicity and immune evasion. Nat. Rev. Cancer 21, 298–312 (2021).
2.Klebanoff, C. A. & Wolchok, J. D. Shared cancer neoantigens: making private matters public. J. Exp. Med. 215, 5–7 (2018).
3.Zhang, Z. et al. Neoantigen: a new breakthrough in tumor immunotherapy. Front. Immunol. 12, 672356 (2021).
4.Mei, S. et al. A comprehensive review and performance evaluation of bioinformatics tools for HLA class I peptide-binding prediction. Brief. Bioinform. 21, 1119–1135 (2020).
5.Darwish, M. et al. High‐throughput identification of conditional MHCI ligands and scaled‐up production of conditional MHCI complexes. Protein Sci. 30, 1169–1183 (2021).
6.Rodenko, B. et al. Generation of peptide–MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat. Protoc. 1, 1120–1132 (2006).
7.Jurtz, V. et al. NetMHCpan-4.0: improved peptide–MHC class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. J. Immunol. 199, 3360–3368 (2017).
8.https://www.bioinfor.com/deepnovo-peptidome/
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2023年10月19日，來自全球第二大生物技術公司Genentech的研究團隊，在Nature Biotechnology雜志上發表了一篇題為 Systematic discovery of neoepitope–HLA pairs for neoantigens shared among patients and tumor types的文章，他們發掘了86個具有免疫原性的候選新生抗原-HLA結合表位，本研究的相關數據將非常有助于研究人員推動在抗原加工以及新抗原表位靶向治療方面的研究進展。本研究使用了PEAKS Online軟件完成了對工程T細胞系的全免疫多肽組質譜數據的準確、無偏鑒定。
T細胞在消除癌細胞方面發揮著關鍵作用1,2，增強內源性腫瘤特異性T細胞活性(例如癌癥疫苗)或引入靶向新抗原的T細胞的免疫療法具有很好的臨床療效3,4。新抗原導向的治療方法需要腫瘤細胞表面具有可被HLA呈遞的新抗原表位，即由突變蛋白衍生的8 – 11個氨基酸多肽。T細胞受體(TCRs)在HLA復合物的背景下與同源肽相互作用，使得治療靶點既可以是新抗原表位序列又可以針對不同HLA的分型。盡管臨床前景看好，但新抗原特異性治療的應用仍受到限制，尤其是可能是某些癌癥亞型的患者中共有的那些，被驗證新抗原表位與HLA的結合的范圍是有限的。
1.高通量TR-FRET測定和NetMHCpan-4.0預測結合用于共有新抗原-HLA結合表位的發掘
首先，通過臨床基因組學篩選出與36個候選新生抗原結合的16個HLA分型，然后結合時間分辨熒光共振能量轉移實驗（TR-FRET）和NetMHCpan-4.0的預測功能對候選的抗原結合表位與HLA-多肽復合物進行表征，結果發現兩種方法約有30%左右的一致性，且各有優勢，在實際研究中，可以結合這兩種方法進行新抗原表位的全面發掘。
圖1 高通量篩選新抗原表位的工作流程2.構建穩定表達47種癌癥共有新生抗原的I型HLA單等位基因細胞系
選擇HMy2.C1R (C1R) 淋巴母細胞，利用CRISPER-Cas9破壞其HLA-C等位基因(HLA-C*04:01)，生成HLA-null細胞群，并通過FACS將目標細胞群富集出來。隨后，通過穩定的慢病毒轉導將15個HLA等位基因作為單個轉基因分別引入新抗原連接子表達和非連接子表達的C1R-HLAnull細胞系，最終共獲得30個細胞群。連接子和無連接子的新抗原工程細胞構建時包含了一組相同的7個已知的HLA-A*02:01遞呈表位。并且，隨后的HLA-IP和靶向質譜分析證實了連接子和非連接子HLA-A*02:01工程細胞中存在的兩種對照肽和前序報道的TP53 R175H23新抗原表位。
圖2 單等位基因工程細胞系的構建工程T細胞構建成功后，通過IP富集出I類HLA多肽，然后通過質譜進行DDA鑒定，得到的質譜原始數據通過PEAKS Online軟件完成分析，最終在各個細胞群中分別鑒定出218-6663個特異的長度在8-11個氨基酸的肽段，且每個等位基因對應的多肽都符合已知基序。在非靶向質譜的結果中，觀察到22個新抗原-HLA結合表位，與5個HLA分型中的15個共有新生抗原相對應，并且這22個表位在TR-FRET和NetMHC中的預測一致性非常高，其中有17個在兩種預測方法中都被認定為結合位點。
圖3 工程T細胞免疫多肽組的質譜鑒定
4.PRM靶向驗證候選結合表位
首先通過TR-FRET RZ評分≥5初步篩選出397條多肽，然后結合NetMHC %Rank≤2和RZ評分< 5篩選出互補的81條，共計對479條候選的新抗原多肽進行合成，然后通過PRM進行靶向鑒定。結果共篩選出86個新抗原表位-HLA結合對和36條新生抗原肽。86個結合對中，有21個是已發表過的，65個是未曾報道的新發現，共55個被TR-FRET與NetMHC預測均認定為預測結合位點。另外，通過與非靶向質譜數據相比，靶向法能更好地識別出結合能力較弱的新表位，且能實現絕對定量。
圖4 靶向質譜法驗證工程T細胞的免疫多肽組
5.全長蛋白的KRAS新抗原表位驗證
為了驗證由全長突變蛋白加工生成的新生抗原肽，構建了4個HLA-A*11:01單等位基因突變的C1R細胞系，包括全長野生型、G12C、G12D或G12V突變的KRAS，并通過全細胞靶向蛋白組驗證各自的信號肽。然后，將先前鑒定到的與HLA-1*11:01相關的兩個KRAS表位進行富集和靶向定量。與全長野生型細胞系相比，G12V和G12D的均被明顯誘導產生更多VVVGAVGVGK的結合表位。最后，在內源性表達相關蛋白和HLA的細胞系中，進一步驗證了發現的候選新抗原結合表位。
圖5 全長蛋白新抗原表位驗證
6.腫瘤特異性抗原-HLA結合對的功能驗證
采用了復合TCR發現法進一步驗證了通過該方案篩選出的新抗原表位可以被人的T細胞識別。以鑒定到的兩個新表位-HLA結合對(FLT3-p.D835Y/A*02:01, PIK3CA-p.E545K/A*11:01))為例，首先將新表位以獨特的組合分配到多肽庫中，然后使用自體單核細胞來源的樹突細胞對健康人供體CD8+ T細胞進行擴增，接著用新表位肽庫重新激活T細胞，再通過激活標志物排序，最后進行TCRβ測序。結果發現，與野生型相比，PIK3CA-p.E545K TCR能夠特異性識別突變的PIK3CA，并且有可能是潛在的治療靶點。
圖6 篩查新抗原-HLA結合對的特異性TCR以驗證免疫原性綜上所述，本研究創建了一個可擴展的新抗原表位- HLA結合對的發現策略。首先選擇了47個癌癥突變和15個HLA等位基因來定義新抗原表位，并由此擴展到假定的臨床靶點。然后，采用高通量HLA結合測定法5.6和NetMHCpan-4.07，在濕實驗和計算預測兩個方面對新抗原-HLA結合對進行篩選。針對上述方法觀察到的新抗原-HLA結合對，分別采用非靶向和靶向質譜法(MS)對HLA單等位細胞系的免疫多肽組進行分析，最終得到86個新抗原-HLA結合對。為了評估這些靶點的治療潛力，通過TCR證明了突變選擇性T細胞對有這些新抗原表達的細胞的靶向殺傷力。
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參考文獻：
1.Jhunjhunwala, S., Hammer, C. & Delamarre, L. Antigen presentation in cancer: insights into tumour immunogenicity and immune evasion. Nat. Rev. Cancer 21, 298–312 (2021).
2.Klebanoff, C. A. & Wolchok, J. D. Shared cancer neoantigens: making private matters public. J. Exp. Med. 215, 5–7 (2018).
3.Zhang, Z. et al. Neoantigen: a new breakthrough in tumor immunotherapy. Front. Immunol. 12, 672356 (2021).
4.Mei, S. et al. A comprehensive review and performance evaluation of bioinformatics tools for HLA class I peptide-binding prediction. Brief. Bioinform. 21, 1119–1135 (2020).
5.Darwish, M. et al. High‐throughput identification of conditional MHCI ligands and scaled‐up production of conditional MHCI complexes. Protein Sci. 30, 1169–1183 (2021).
6.Rodenko, B. et al. Generation of peptide–MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat. Protoc. 1, 1120–1132 (2006).
7.Jurtz, V. et al. NetMHCpan-4.0: improved peptide–MHC class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. J. Immunol. 199, 3360–3368 (2017).
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