基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償缺陷和異常基因引起的疾病，以達到治療目的。基因治療的載體在基因治療過程中起著至關重要的作用，一些病毒制劑和人工遞送技術已經被用來嘗試安全地將蛋白受體或核酸載體遞送到宿主細胞中進行復制，起到治療效果。然而，一些病毒載體的不良特性，包括它們的免疫原性，或它們引起的強烈副作用，已經導致了嚴重的臨床不良事件，并限制了它們目前在臨床中的某些應用。

腺相關病毒(Adeno-associated virus, AAV)因具有低致病性、對宿主免疫原性弱、長期穩定表達、廣泛的細胞和組織親嗜性等優點而被廣泛用于研發和臨床應用領域，是目前研究最活躍的基因治療載體之一，已經有超過200個AAV藥物進入臨床試驗和3個藥物已上市。AAV由一個蛋白質衣殼組成，該衣殼包裹著一個大小約為4.7kb的小基因組，并依賴于與輔助病毒的共感染來進行復制。AAV衣殼由三種病毒蛋白（VP1、VP2和VP3）組成，其比例、鑒別、純度影響藥物效能和效價強度，需要被鑒定并監控以確保藥物質量。AAV衣殼是病毒基因組的保護結構，也是病毒復制的起源和包裝信號，是影響病毒感染活性和基因轉導的關鍵因素。不同血清型之間的衣殼蛋白質具有較高一致性，因此在基因治療方法的開發和商業化過程中需要使用高效、可靠的載體鑒定方法。

為使VP1、VP2和VP3可視化，我們利用SDS-PAGE銀染法來產生定性數據，此過程耗時費力且重現性差。LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統提高了AAV純度分析的速度、通量和數據質量。利用SDS存在下的微流控毛細管電泳技術分離AAV衣殼蛋白，并測定每種病毒衣殼蛋白的大小和濃度。

LabChip®GXII Touch™系統的ProteinEXact™試劑采用系統校準步驟，可實現高精度重現性，并具有更高的靈敏度和較寬的分析范圍。65秒內即可完成樣品分析。這種高通量的分析方法可以同時測定96份AAV樣品，并提供傳統毛細管電泳無法比擬的可比結果。

利用ProteinEXact™試劑，LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統可以提供：

• 定量和數字化的結果
• 標準化分析流程
• 多個用戶、多臺儀器上結果的可重復性
• 分析速度快

高通量

圖1：（A） LabChip® GXII Touch™儀器（B）芯片，可測試多達400個樣品（C）顯示蛋白質如何在微流控通道中得以分離和脫色

Protein EXact™ Assay檢測AAV衣殼蛋白

AAV的熱穩定性因血清型不同而有所變化，衣殼蛋白組成的比例類似，即VP1:VP2:VP3=1:1:10²。LabChip®GXII Touch™蛋白鑒定系統采用PerkinElmer的ProteinEXact™分析技術，利用IntelliChip™分析優化技術，使樣品的蛋白濃度分析具有高分辨率和可重復性，從而使重組病毒生產的AAV鑒定具有最高的準確性。

圖2：AAV8完全變性后衣殼蛋白Labchip電泳圖譜，樣品重現性好

幾種血清型(AAV2、AAV8和AAV9)的空衣殼顆粒被用于這些實驗。為了分離衣殼顆粒，AAV樣品在洗滌劑的存在下反復加熱。由于不同的AAVs具有不同的穩定性，因此對每個血清型分別選擇了不同的溫度。如圖2所示，完全變性的AAV8顆粒在SDS存在的情況下，在80℃加熱后，只有三個峰的分子量分別為80、90和115kDa左右。

AAV動力學觀察實驗（穩定性）

為了研究AAV變性的時間條件，對每個重組構建體進行了動力學實驗。LabChip™GXII Touch™蛋白鑒定系統能夠在30-50秒內收集多達300個實驗點，這可能為衣殼蛋白提供額外的信息。

圖3A和3B：動力學實驗中部分變性的AAV8（圖3B—只顯示二聚體）

部分變性衣殼可由不同蛋白質分子量(單體、二聚體、三聚體等)的混合物組成，如圖3所示。在實驗期間。在1% SDS和TE緩沖液中加入AAV樣品的96孔板被加熱到特定的溫度進行變性，隨后進行檢測。

AAV糖基化檢測實驗

一些研究者在LabChip®GXII Touch™蛋白表征系統的實驗中，觀察到VP3的主要峰上有明顯的“小峰”。最近，Sara Murrey等人報道了AAV2衣殼蛋白的糖基化，并從理論上估算了衣殼蛋白表面糖基化的四個可能位置。為了研究衣殼糖基化的假設，我們使用我們研發實驗室之前開發的酶處理(PNGase F消化)對AAV2、AAV8和AAV9顆粒進行去糖基化；圖4中的數據顯示了處理前(a)和處理后(b)的AAV8。在圖4b中，觀察到VP3峰的分子量變化為79 kDa，而圖4a中未處理的VP3的分子量變化為81kDa。對于VP2 (92kDa vs. 94kDa)和VP1 (113kDa vs.115 kDa)，可以觀察到大約2kDa的相同變化。觀察結果與衣殼蛋白上糖基化的平均分子量一致。

圖4A和4B：變性AAV8去糖基化結果

為了證明去糖基化的再現性，我們對變性的AAV顆粒進行了額外的實驗。圖5顯示了與圖4相同的三種衣殼蛋白分子量變化的重疊電泳圖。此外，在LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統中也可以顯示虛擬膠圖結果，其前后的分子量變化非常明顯。

圖5：去糖基化前后AAV8檢測結果

我們展示了LabChip®GXII Touch™蛋白分析系統上利用ProteinEXact™對AAV樣品進行多項檢測的結果，證明該平臺提供AAV衣殼蛋白的全面分析的能力。該方法為AAV衣殼蛋白鑒定提供了一種快速、高通量、穩定可靠的方法。高重現性和準確的衣殼成分檢測可以作為重組AAV病毒顆粒表征的新方法，是基因治療應用的關鍵一步。另外，衣殼蛋白糖基化的高分辨率驗證進一步有利于重要治療成分的生產。

參考文獻

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5. Sara Murrey et.al. Characterization of the capsid protein glycosylation of adeno-associated virus type 2 by high-resolution mass spectrometry 2006 Journal of Virology,80: 6171–6176.