mosquito應用:基于Illumina測序平臺的DNA文庫構建微縮化
簡介
近年來二代測序技術發展迅速，以其高通量、低成本的優勢，廣泛應用于生命科學研究中。對于高通量測序核心平臺而言，測序技術的發展使得文庫構建流程面臨更低交付成本及更快交付速度的挑戰，而自動化液體處理工作站的出現緩解了這一瓶頸。本文闡述了mosquito HV如何成功完成基于Illumina測序平臺的DNA文庫構建微縮化，體積僅為手動標準流程的十分之—。
mosquito HV是英國SPT Labtech公司研發生產的自動化液體工作站，采用獨特的固相置換技術，一次性槍頭內的不銹鋼活塞直接與液體接觸，通過控制活塞的移動來進行移液（圖1)。因此，mosquito可以對低至25nl的液體進行精準移液，無需進行槍頭校準和液體定義。
之所以選擇NEBNext Ultra II FS DNA方法， 是因為它使用酶切打斷實現片段化，無需進行物理超聲打斷。使用ZymoBIOMICS 微生物群落標準品作為基因組DNA, 在使用不同起始量的input DNA情況下，將mosquito HV制備的微縮化文庫與手動制備的標準體積文庫進行比較。為了確定樣本起始量較低時的結果，則使用單個菌株樣品的微縮化NEBNext Ultra II FS DNA文庫，和相同條件下手動制備的Illumina TruSeq Nano文庫進行比較。此外還對NEBNext Ultra II FS DNA自動化建庫與TruSeqNanoh、TruSeq PCR Free手動或傳統工作站建庫進行比較。
手動 VS 自動建庫
本次實驗以ZymoBIOMICS微生物群落標準品(Cat. No. D6306)為樣本，測試NEBNext Ultra II FS DNA文庫試劑盒。該標準品包含10種微生物菌種的基因組DNA混合物，目前被廣泛用于宏基因組學工作流程的驗證和質量控制， 它能反映實驗過程中可能出現的偏差和錯誤，是測試文庫構建試劑盒的理想工具。此外，它還可以直接與CGR先前測試過的建庫試劑盒進行性能比較。測試起始量分別為50ng、1ng、0.1ng, 一式三份。
臨床與細菌分離物的性能比較
使用ZymoBIOMICS微生物群落DNA標準品得出了令人滿意的分析結果，但這并不代表使用實際樣本可以達到同樣效果。此前曾手動制備TruSeqNano文庫，使用100ng的input DNA,從臨床分離的細菌樣本中生成數據。現使用自動化平臺，縮減樣本量至1/10, 在NEBNext Ultra II FS DNA加入10ng DNA,井對結果進行比較。
圖5. Average yields for the manual TruSeq Nano and 1/10 automated NEB libraries generated from clinical bacterial isolates. 100 ng and 10 ng of input DNA were used for the TruSeq Nano and NEB 1/10 libraries, and 8 and 10 cycles of PCR, respectively. Error bars are standard deviation.
圖6. Sequence data were normalized to 1.3M reads per library.
Bar chart shows averages of duplicate and mapping percentages,
and fold coverage of the genome. Error bars are standard deviation.
圖7. Sequence data were normalized to 13M reads per library. Bar charts show averages of
A) percentage duplicates, B) percentage mapping,
and C) fold coverage (X) of the mock community. Error bars are standard deviation.
結論
本研究表明，NEBNext Ultra II FS DNA文庫以1/10體系制備，其性能不亞于人工制備的原始體系文庫，且通過反應體系的微縮化大幅節約了試劑成本。重復率、對比率、覆蓋度和GC偏差（未在本文呈現）都與加入1ng DNA的情況下相當。整個工作流程可以在一天內完成，從而使樣本量更多的大型項目得以運行，并有效減少技術誤差。
SPT Labtech
SPT Labtech是生命科學領域自動化儀器及耗材設計與開發的國際制造商。中國總部位于上海，專注于服務蓬勃發展的中國生命科學研究事業。
近年來二代測序技術發展迅速，以其高通量、低成本的優勢，廣泛應用于生命科學研究中。對于高通量測序核心平臺而言，測序技術的發展使得文庫構建流程面臨更低交付成本及更快交付速度的挑戰，而自動化液體處理工作站的出現緩解了這一瓶頸。本文闡述了mosquito HV如何成功完成基于Illumina測序平臺的DNA文庫構建微縮化，體積僅為手動標準流程的十分之—。
mosquito HV是英國SPT Labtech公司研發生產的自動化液體工作站，采用獨特的固相置換技術，一次性槍頭內的不銹鋼活塞直接與液體接觸，通過控制活塞的移動來進行移液（圖1)。因此，mosquito可以對低至25nl的液體進行精準移液，無需進行槍頭校準和液體定義。
之所以選擇NEBNext Ultra II FS DNA方法， 是因為它使用酶切打斷實現片段化，無需進行物理超聲打斷。使用ZymoBIOMICS 微生物群落標準品作為基因組DNA, 在使用不同起始量的input DNA情況下，將mosquito HV制備的微縮化文庫與手動制備的標準體積文庫進行比較。為了確定樣本起始量較低時的結果，則使用單個菌株樣品的微縮化NEBNext Ultra II FS DNA文庫，和相同條件下手動制備的Illumina TruSeq Nano文庫進行比較。此外還對NEBNext Ultra II FS DNA自動化建庫與TruSeqNanoh、TruSeq PCR Free手動或傳統工作站建庫進行比較。
手動 VS 自動建庫
本次實驗以ZymoBIOMICS微生物群落標準品(Cat. No. D6306)為樣本，測試NEBNext Ultra II FS DNA文庫試劑盒。該標準品包含10種微生物菌種的基因組DNA混合物，目前被廣泛用于宏基因組學工作流程的驗證和質量控制， 它能反映實驗過程中可能出現的偏差和錯誤，是測試文庫構建試劑盒的理想工具。此外，它還可以直接與CGR先前測試過的建庫試劑盒進行性能比較。測試起始量分別為50ng、1ng、0.1ng, 一式三份。
圖2. Fragment Analyzer traces comparing the size distribution of manual
and 1/10 automated libraries for A) 50 ng, B) 1 ng, and C) 0.1 ng of input DNA.
and 1/10 automated libraries for A) 50 ng, B) 1 ng, and C) 0.1 ng of input DNA.
圖3. Sequence data were normalized to 13M reads per
library, A) indicates average levels of duplicate and mapping
percentages, B) shows average fold coverage. Error bars indicate standard deviation.
臨床與細菌分離物的性能比較
使用ZymoBIOMICS微生物群落DNA標準品得出了令人滿意的分析結果，但這并不代表使用實際樣本可以達到同樣效果。此前曾手動制備TruSeqNano文庫，使用100ng的input DNA,從臨床分離的細菌樣本中生成數據。現使用自動化平臺，縮減樣本量至1/10, 在NEBNext Ultra II FS DNA加入10ng DNA,井對結果進行比較。
圖4. Fragment Analyzer traces comparing the size distribution of manual TruSeq Nano and 1/10 volume automated NEBNext Ultra II FS DNA libraries.
圖5. Average yields for the manual TruSeq Nano and 1/10 automated NEB libraries generated from clinical bacterial isolates. 100 ng and 10 ng of input DNA were used for the TruSeq Nano and NEB 1/10 libraries, and 8 and 10 cycles of PCR, respectively. Error bars are standard deviation.
圖6. Sequence data were normalized to 1.3M reads per library.
Bar chart shows averages of duplicate and mapping percentages,
and fold coverage of the genome. Error bars are standard deviation.
1/10體積NEB Ultra II FS自動文庫 VS 標準體積自動/手動 TruSeq Nano和TruSeq PCR free文庫
此前，CGR的工作流程使用的是Illumina TruSeq Nano 或TruSeqPCR Free建庫。使用上述方法（原始體系的手動及貝克曼FXP自動化系統）獲得數據。TruSeq Nano 或TruSeq PCR Free文庫分別使用了100ng和1µg的ZymoBIOMICS微生物群落DNA標準品。當將50ng DNA 投入到1/10體積的NEB NEBNext Ultra II FS 進行DNA 文庫構建時，三種方法的數據具有可比性。圖7. Sequence data were normalized to 13M reads per library. Bar charts show averages of
A) percentage duplicates, B) percentage mapping,
and C) fold coverage (X) of the mock community. Error bars are standard deviation.
結論
本研究表明，NEBNext Ultra II FS DNA文庫以1/10體系制備，其性能不亞于人工制備的原始體系文庫，且通過反應體系的微縮化大幅節約了試劑成本。重復率、對比率、覆蓋度和GC偏差（未在本文呈現）都與加入1ng DNA的情況下相當。整個工作流程可以在一天內完成，從而使樣本量更多的大型項目得以運行，并有效減少技術誤差。
SPT Labtech
SPT Labtech是生命科學領域自動化儀器及耗材設計與開發的國際制造商。中國總部位于上海，專注于服務蓬勃發展的中國生命科學研究事業。
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