SCIENION點樣技術在DNA合成的半導體芯片進行表面功能化處理中的應用
SCIENION* EVONETIX利用 SCIENION 的精密點樣技術對 EVONETIX 用于 DNA 合成的半導體芯片進行表面功能化處理
摘要
在這項研究中，Evonetix公司和 Scienion公司合作開發了一種在硅半導體芯片上進行高度并進行DNA 合成的可擴展工藝。利用 Scienon 的精密點樣技術，在 Evonetix的 DNA合成平臺上點樣了一個啟動DNA合成的鏈接物 ,直徑為100微米的金點。研究結果表明，鏈接物可以精確地放置在反應點上，從而最大限度地減少溢出，并最大限度地減少相鄰 DNA 序列之間的串擾。Evonetix 在 DNA 合成研究中成功證明了涂層芯片的功能。
Evonetix
Evonetix公司是一家總部位于劍橋的公司，致力于開發新型半導體技術，以大規模生成高保真度的DNA。
這款桌面DNA合成平臺提供了前所未有的精確度、規模和速度進行DNA合成的能力。
DNA合成在半導體芯片上實現的獨立溫控反應點位上進行（圖 1）。
在反應位點上沉積一層薄薄的金屬層，下一步將使用內部開發的基底涂層對其進行功能化處理。
該涂層可實現與金屬點的共價結合，隨后固定連接體。連接體帶有一個活性頭基的分子，用于結合第一個磷酰胺酸二酯，啟動單鏈DNA合成。芯片本身被組裝到一塊印刷電路板中。芯片頂部有一個流體室。
SCIENION
Scienion GmbH 是一家提供完整解決方案的公司，
專注于開發和制造用于診斷和其他生命科學領域的微型化多重檢測。
Scienion 公司的核心技術基于皮升和納升范圍內的非接觸點樣，起點為 10 pL/滴。除了儀器和耗材，Scienion 還提供一系列定制開發和制造服務。在本應用說明中，我們進行了原理驗證 (POP) 研究，以了解 Evonetix 半導體芯片上的點樣工藝技術。
最后，Scienion的點樣技術成功應用于功能化Evonetix的DNA合成平臺。
因此，在已預先預涂的100微米大的金反應位點上分配了一個連接物，以啟動半導體芯片上的DNA合成。
包括:(1)壓電點樣毛細管;(2)點樣后用于對目標成像的垂直攝像頭;(3)用于可視化和量化滴液參數的高分辨率攝像頭。
結果與討論
初步研究
首先，利用 Scienion 的定制開發服務，進行了一項初步研究,以了解芯片表面、滴液量和斑點直徑之間的相互作用。
表面潤濕性對光斑直徑的影響
為了估算覆蓋 Evonetix 芯片上 100 µm 直徑金反應位點所需的滴液體積，使用 Scienion 的精密點樣技術將不同體積（80 - 320 pL）的水滴點樣到不同的目標上。通過垂直攝像頭拍攝沉積的滴液（斑點）的照片，并通過 sciFLEX 軟件分析它們的直徑。此外，還對相關支撐材料進行了水接觸角測量，以分析它們的潤濕性質。最后，還評估了潤濕性質對斑點直徑的影響。
作為研究的主要支持物，使用未涂層的金基片（CA：96°）和基底涂層金基片（CA：95°）來模擬金位點。這兩種載玻片均由 Evonetix 公司提供。為了進行比較，另外使用了sciCHIP H2（CA：106°）和sciCHIP Epoxy（CA：53°）載玻片作為額外的參考表面。
不同緩沖條件對斑點形成（斑點大�。┑挠绊�
Evonetix的半導體芯片上直徑100 µm的反應位點需要覆蓋DNA連接劑。我們研究了三種緩沖液中哪種最適合將 DNA 連接固定在預涂覆的金位點上。此外，將滴液量在200 pL和3200 pL之間變化，以評估最佳分配體積。檢測在涂有金的載玻片上進行，以研究緩沖液組成和滴液量對斑點形成的影響。
以 200 pL/滴/輪的順序分配 200 - 3200 pL/斑點，輪次之間等待時間為2分鐘。每個序列后測量斑點直徑（圖4）。使用了Evonetix提供的Evx緩沖液和Scienion提供的sciSPOT B2作為緩沖試劑。此外，Evx緩沖液與sciSPOT B2混合，結合了兩種緩沖液的特性。
使用Evx 緩沖液時，分配200 pL 時，光斑直徑為 98 ± 2 µm，分配 400 pL 時，光斑直徑為 127 ± 3 µm。沉積 800 pL 后，每多沉積一輪，光斑直徑增加不到 10%。使用sciSPOT B2 緩沖液時，200 pL 的直徑為 102 ± 2 µm，400 pL 的直徑為 115 ± 5 µm。每增加一輪點樣，光斑直徑幾乎線性增加 5-13%。使用Evx 緩沖液 + sciSPOT B2 緩沖液時，200 pL 的光斑直徑為 79 ± 3 µm，400 pL 的光斑直徑為 110 ± 2 µm。
在 200 - 800 pL（增加 40-47%）和 800 - 3200 pL（增加 4-13%）之間，光斑直徑幾乎呈線性增長(增加 4-13%）。
覆蓋 100 µm 圖層金表面所需的體積約為 200 pL。所有測試的三種緩沖液都能覆蓋目標的光斑直徑。我們決定使用Evx 緩沖液 + sciSPOT B2 緩沖液 的組合特性來沉積 DNA 連接體，以達到最佳固定效果。
利用 Scienion 的精密點樣技術實現 Evonetix 芯片的功能化
Evonetix的芯片具有獨立溫度控制的反應位點，在Scienion處進行了基底涂層的功能化處理。芯片被組裝到芯片載體中，連接到流體夾具上，進行清洗，并根據Evonetix提供的方案進行反應性和熱穩定性涂層的功能化處理。在接下來的步驟中，帶有芯片的載體被放置在sciFLEXARRAYER SX的靶板上（見圖5）。靶板冷卻至8°C，相對濕度設定為65%。
作為試劑，ssDNA-Cy5 和一個連接物被打印在反應位點上。第一種試劑用作陽性對照，而第二種試劑可在隨后的合成過程中固定第一個 DNA 堿基。大約需要200pL試劑才能覆蓋直徑為100µm 的反應位點，確保不會溢出到相鄰區域（圖6），這驗證了在不同緩沖液條件下的初步研究結果。
201 pL/滴磷酸鹽緩沖液中的連接體。
(b) 204 pL/drop of ssDNA-Cy5 in Evx buffer +sciSPOT B2 mix204 pL/滴ssDNA-Cy5，Evx 緩沖溶液 +sciSPOT B2 混合液。
圖6：通過 sciFLEXARRAYER SX的水平攝像頭拍攝的200 pL水平圖像。
芯片上的反應位點按三個區域排列，每個區域有3x3個反應點。
每個區域內的反應點之間的間距為400微米（雙向），區域之間的間距為2800微米。
在點樣過程中，每個區域的 3/3 位點留空，ssDNA-Cy5 沉積在 2/2 位點（中心點）。
連接物被沉積在其余位點上（圖7）。
試劑按兩輪順序預埋：先噴 200 pL 試劑，5 分鐘后再在每個部位沉積 200pL相同的試劑，以增加試劑的累積量。最終的平均光斑直徑為 120 µm ± 10 µm，這表明溢出極少。沉積完成后，芯片在相對濕度為 70% 的室溫下培養過夜。剩余的試劑通過清洗程序從表面清除。
ssDNA被合成在所有連接功能化的金位點上（陽性對照的2/2位和空位3/3除外），并與 ROX 標記的互補 ssDNA 雜交。使用 Leica DMi8 熒光顯微鏡觀察 ROX 標記的 ssDNA 的熒光圖像表明，在先前連接功能化的反應位點上成功合成了目標 ssDNA（圖 8a）。測得的熒光強度為 5715 ± 395 RFU，是 3/3 位置未功能化反應位點（1130 ± 90 RFU）的 5 倍。陽性對照ssDNA-Cy5在2/2位置的熒光強度比未涂層的反應位點高出9倍（陽性位點：17117 ± 4248 RFU；未涂點的對照位點：1911 ± 87 RFU）。
圖 8：使用 Leica DMi8 熒光顯微鏡在同一芯片上拍攝的熒光圖像（a）ROX 標記的輔助 ssDNA 與合成在連接器功能化位點上的ssDNA雜交后的圖像（LED 激發 560 納米，發射濾光片 592-668 納米，5 倍放大鏡）
b）陽性對照的熒光圖像（LED 激發 635 納米，發射濾光片 666-724 納米，5 倍放大鏡）。
隨后的研究中，我們在金位點上沉積了3滴連接劑，
以研究固定連接劑的密度如何影響ssDNA的合成量：2滴、6滴和 8滴（每滴 200 pl）。
與ROX標記的互補ssDNA雜交后，拍攝熒光圖像（Leica DMi8熒光顯微鏡）并測量熒光強度（圖 9）。
可以得出的結論是，隨著固定的連接劑的增加，熒光強度也隨之增加，合成的ssDNA量也隨之增加。
6滴/點的沉積導致熒光強度：
- 與沉積2滴連接劑后的熒光強度相比幾乎高出3倍
- 與沉積8滴/點連接劑后獲得的熒光強度相比處于同一數量級。
結論
Scienion的精密點樣技術成功應用于Evonetix開發的DNA合成平臺的100微米大金位點的功能化。
我們對不同的點樣參數（包括緩沖液和連接劑濃度）進行了評估，以確定DNA合成的最佳參數。
我們能夠證明，在同一反應位點上點樣 2-3 滴（200 pL）連接劑會導致信號增加。點樣六滴足以使點樣區域的反應位點達到飽和，超過飽和后，信號不再增加。
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