熒光顯微鏡應用于病毒學研究

瀏覽次數：1197　發布日期：2024-4-29　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

一、病毒

病毒是一種個體微小，結構簡單，只含一種核酸（DNA或RNA），需要在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型生物。病毒是一種非細胞生命形態，它由一個核酸長鏈和蛋白質外殼構成，病毒沒有自己的代謝機構，沒有酶系統。因此病毒離開了宿主細胞，就成了沒有任何生命活動、也不能獨立自我繁殖的化學物質。它的復制、轉錄和轉譯的能力都是在宿主細胞中進行，當它進入宿主細胞后，它就可以利用細胞中的物質和能量完成生命活動，按照它自己的核酸所包含的遺傳信息產生和它一樣的新一代病毒。

流感病毒渲染圖

二、光學顯微鏡在病毒學研究中的應用

相比于常見細胞的幾十微米級別尺寸，病毒的尺寸小很多，一般在60-220nm，而受制于可見光的衍射峰值，光學顯微鏡無法分辨200nm以下的物體，因此無法對病毒進行結構尺度的觀測，目前應用光學顯微鏡對病毒進行觀測研究主要是從以下兩個方面著手：

（1）通過觀測對病毒進行特異性標記產生的熒光信號，從而實現對病毒位置數量的判斷。病毒主要由核酸和蛋白質組成，常見的一種方法是利用熒光標記的特異核酸探針與病毒含有的靶DNA分子或RNA分子進行雜交，可通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的病毒的分布和數量，這種方式也稱為原位熒光雜交技術（FISH）。

FISH做的病毒檢測，紅色為病毒外殼蛋白
（引自公開論文https://doi.org/10.1073/pnas.1820132117）

（2）通過檢測病毒入侵導致細胞產生的免疫物質或病理形態變化，從而判斷病毒種類、分布和數量。正常細胞在面對病毒入侵時，會發生免疫反應，產生的免疫物質就可作為熒光染料標記的結合物，通過熒光顯微鏡對免疫熒光信號進行觀測從而做出檢測判斷，這種通過對免疫蛋白進行標記的方式也稱之為免疫熒光（IF），這種方式在臨床上常見的應用有呼吸道七聯檢或九聯檢。

呼吸道七聯檢免疫熒光，MF31拍攝（綠色為病毒反應）

應用類似原理，還有不使用熒光染色的免疫組化(IHC)染色，主要用于尸檢研究，判斷病毒對身體各器官的感染情況，比如新冠病毒和猴痘病毒都能找到相關研究。

IHC免疫組化染色，猴痘病毒感染犬的支氣管（紅色為病毒反應）

病毒入侵也會導致細胞或組織發生病理變化，如感染細胞與未感染細胞的胞漿膜發生融合，形成多核的巨細胞，或某些病毒感染細胞時，在光學明場顯微鏡下可見胞漿或胞核內出現嗜酸或嗜堿性染色、大小不同和數量不等的圓形或不規則的團塊結構，如HPV人乳頭狀瘤病毒。

HPV引起，分化不良的鱗狀細胞癌

三、顯微成像技術在病毒觀測中的挑戰

根據上述光學顯微鏡對病毒的檢測方式，主要有兩種方式，一是使用熒光顯微鏡檢測熒光染料標記病毒本身的熒光信號或入侵細胞免疫反應產生抗體物質熒光信號，二是使用明場方式觀測IHC或者HE染色的細胞或組織的病理形態。

主要的挑戰來自病毒本身體積小，含量相對較低，導致熒光染料產生的熒光信號弱，需要使用較強的激發光與高靈敏度的顯微相機進行成像；使用免疫熒光方式檢測病毒對特異性染料的選擇及熒光顯微鏡濾光片的選擇要求較高，需要保證病毒標志物熒光信號不被其它種類的熒光信號所覆蓋，對通道的選擇及熒光圖像軟件的合成有很高的要求。