【Cell】Spatially coordinated heterochromatinization of long synaptic genes in fragile X syndrome

脆性X綜合征中長突觸基因的空間協調異染色質化

脆性X綜合征（FXS）是由FMR1基因5’UTR區中CGG短串聯重復序列（STR）的擴增引起的。在這類重復擴增疾病中，短串聯重復序列（STR）的不穩定性會導致轉錄沉默。對于FXS，CGG重復次數達突變長度（mutation-length，ML）后，會通過局部DNA甲基化抑制FMR1基因表達。作者在FXS患者衍生的iPSC、iPSC衍生的神經祖細胞、EBV轉化的淋巴母細胞和具有突變長度CGG擴增的腦組織中，常染色體上發現了Mb級H3K9me3結構域，并且X染色體上的FMR1基因也有同種結構。H3K9me3結構域通過染色體間相互作用連接，并分為染色體拓撲結構域（topologically associated domain，簡稱TAD） 嚴重錯誤折疊和成環，它們存在于S末期復制的長突觸基因中，復制應激誘導的斷裂雙鏈中，以及易發生逐步體細胞不穩定性的STR中。將突變長度（mutation-length，ML）CGG轉換成突變前長度（premutation length， PL）的CRISPR工程，可逆轉X染色體和多個常染色體上的H3K9me3重折疊TADs區域，并恢復基因表達。H3K9me3結構域也可以出現在正常長度的iPSC中，這表明它們之間聯系不局限于FXS。研究結果揭示了易受不穩定性影響的基因座之間的Mb級異染色質化和反式相互作用。

該研究利用 Nanopore 納米孔測序、Mb級 Hi-C、CRISPR 和單細胞 Oligopaint FISH 成像等技術，發現脆性 X 染色體綜合征（FXS）患者的常染色體上也存在 CGG 域的 DNA 甲基化，提出空間協調轉錄沉默模型，為 FXS 疾病的分子機制探究開辟新方向。與正常情況對比，具有ML CGG擴增的FXS患者衍生的細胞系和腦組織更容易在常染色體和X染色體上產生Mb級H3K9me3結構域。H3K9me3結構域在S期結束時復制，以反式相互作用，并產生TADs、亞TAD以及環等不同類型嚴重Mb級錯誤折疊。它們與長突觸基因，復制應激誘導的雙鏈斷裂，以及易受逐步體細胞不穩定性影響的STR緊密相關。通過將ML CGG轉化為PM CGG，可以逆轉X染色體和多個常染色體上H3K9me3信號；此時TAD被重折疊，反式相互作用不受限制，基因表達恢復。研究結果揭示了BREACHes（beacons of repeat expansion anchoredby contacting heterochromatin，通過接觸異染色質錨定的重復擴增信標）——連接Mb級H3K9me3結構域、順式中嚴重的染色質錯誤折疊、長程染色體間相互作用和重復基因組的不穩定性。

文中通過CRISPR-Cas9靶向剪切FMR1基因座5’UTR區中CGG短串聯重復序列后，使用Blue Pippin全自動DNA電泳回收儀，選用“0.75DF 3-10 kb Marker S1”試劑盒，精準回收5-12 kb Cas9-cut DNA，構建靶向長讀長文庫，并在MinION測序儀上進行了長讀長測序。

原文
Malachowski, Thomas, et al. "Spatially coordinated heterochromatinization of long synaptic genes in fragile X syndrome." Cell 186.26 (2023): 5840-5858.

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