PEAKS在乳腺癌新抗原精準發現的應用
乳腺癌是女性乳房組織中發生的一種惡性腫瘤，盡管男性也可能患有乳腺癌，但女性是其主要發病人群，占所有女性癌癥發病的約25％；盡管在過去的幾十年治療有很大進展，但轉移性乳腺癌仍然是無法治愈的。從免疫學的角度來看，激素受體陽性乳腺癌(HR+)被認為是免疫上“冷”腫瘤，并沒有受益于最近的免疫治療進展。相比之下，三陰性乳腺癌(TNBC)亞型在免疫上屬于“熱”腫瘤。白細胞浸潤和對免疫檢查點封鎖(ICB)的反應性證明了這一點。HR+和TNBC腫瘤免疫原性差異的原因尚不清楚，CD8+ T細胞是抗腫瘤反應的主要效應器，可識別MHC I相關肽(MAPs)，HR+和TNBC中MAP庫的差異或許可解釋這種差異。
2024年1月，加拿大蒙特利爾大學的Pierre Thibault教授課題組在The Journal of Clinical Investigation上發表了題為“Breast cancer immunopeptidomes contain numerous
shared tumor antigens”的文章，該文章使用質譜法，對26例原發性乳腺癌樣本進行了全面的蛋白質基因組學分析。研究者利用每個樣本的RNA-Seq數據建立了包含內源性逆轉錄因子（ERE）蛋白質組、smRNA蛋白質組、及癌癥特異性蛋白質組的個性化參考數據庫，利用PEAKS軟件對每個樣本的質譜數據鑒定出共57094個MHC I相關肽。接下來，將乳腺癌TCGA樣本分為異常表達的腫瘤特異性新抗原 (aeTSAs)數量高和低兩組，并對兩組進行差異基因表達分析，通過白細胞浸潤基因標記進行基因集富集分析（GSEA）闡述了異常表達腫瘤新抗原（aeTSAs）的免疫浸潤結果。本研究還進行了特異性T細胞功能擴增（FEST）試驗評估了鑒定抗原的免疫原性以及總生存率分析評估了腫瘤相關抗原（TAAs）和異常表達腫瘤特異性新抗原（aeTSAs)的數量是否與TCGA中患者的總生存期相關。
研究方法
該研究選取了26例原發性乳腺癌樣本：HR+ (ER或PR陽性，HER2陰性；n=14)或TNBC (ER/PR/HER2陰性；n=12)，腫瘤組織通過免疫沉淀獲得MHC I免疫組，通過RNA-seq構建個性化數據庫，并使用PEAKS X Pro在相關數據庫中檢索LC-MS/MS數據（方法如下圖所示），隨后對鑒定出的免疫肽進行差異基因表達分析，免疫原性分析，特異性T細胞功能擴增(FEST)試驗以及TAAs和aeTSAs的數量是否與TCGA中患者的總生存期相關分析。
shared tumor antigens”的文章，該文章使用質譜法，對26例原發性乳腺癌樣本進行了全面的蛋白質基因組學分析。研究者利用每個樣本的RNA-Seq數據建立了包含內源性逆轉錄因子（ERE）蛋白質組、smRNA蛋白質組、及癌癥特異性蛋白質組的個性化參考數據庫，利用PEAKS軟件對每個樣本的質譜數據鑒定出共57094個MHC I相關肽。接下來，將乳腺癌TCGA樣本分為異常表達的腫瘤特異性新抗原 (aeTSAs)數量高和低兩組，并對兩組進行差異基因表達分析，通過白細胞浸潤基因標記進行基因集富集分析（GSEA）闡述了異常表達腫瘤新抗原（aeTSAs）的免疫浸潤結果。本研究還進行了特異性T細胞功能擴增（FEST）試驗評估了鑒定抗原的免疫原性以及總生存率分析評估了腫瘤相關抗原（TAAs）和異常表達腫瘤特異性新抗原（aeTSAs)的數量是否與TCGA中患者的總生存期相關。
研究方法
該研究選取了26例原發性乳腺癌樣本：HR+ (ER或PR陽性，HER2陰性；n=14)或TNBC (ER/PR/HER2陰性；n=12)，腫瘤組織通過免疫沉淀獲得MHC I免疫組，通過RNA-seq構建個性化數據庫，并使用PEAKS X Pro在相關數據庫中檢索LC-MS/MS數據（方法如下圖所示），隨后對鑒定出的免疫肽進行差異基因表達分析，免疫原性分析，特異性T細胞功能擴增(FEST)試驗以及TAAs和aeTSAs的數量是否與TCGA中患者的總生存期相關分析。
數據搜索的工程流程研究結果
研究結果
1. HR+和TNBC腫瘤的典型免疫肽組相似
作者利用大型免疫肽數據集來發現假定的乳腺癌MAP，MAPs of interest (MOIs)被分類為TAAs、aeTSAs或mTSAs，工作流程如圖2A所示。最終，該研究確定了25個TSA(1個mTSA、24個aeTSA）和49種TAAs，其中大部分未被列入免疫表位數據庫(IEDB)(圖2B、C)。
3. TSAs在TNBC中比HR+乳腺癌更豐富
在24個aeTSAs中，17個由典型外顯子編碼：14個來源于癌胚抗原(CTA)的MAGE family CTAs家族，2個來源于編碼細胞外基質成分的基因(COL11A1, ITH6)，1個來源于跨膜蛋白編碼基因(ABCC11)；7個aeTSAs來源于非蛋白質編碼區，2個與EREs重合，為ERE-derived MAP(圖3)。統計發現，TNBC樣品中aeTSAs 更豐富(圖2 B)。研究者進一步評估TNBC樣本中aeTSAs的豐富鑒定是否與TCGA隊列中的TSA表達相關。在TNBC中，表達癌胚抗原 (CTA)類腫瘤個體aeTSAs的比例高于HR+腫瘤(19%比8%，P = 0.004)(圖3C)。將乳腺癌TCGA樣本分為高(高于中位數)和低(低于中位數)aeTSAs數量兩組，使用白細胞浸潤標記基因進行GSEA分析，結果顯示，這些基因在高TSA數量的腫瘤中富集(圖3D)，這表明一些TSAs在體內具有免疫原性。
4. TAAs在乳腺癌中有很高的比例
作者鑒定了49種TAAs，其中有48種來源于規范蛋白編碼區(圖4A)，這些抗原在HR+和TNBC腫瘤中都具有高度的共通性(圖4B)。14種TAAs來源癌癥相關成纖維細胞(CAFs)標志物的基因(COL11A1, COL10A1, LRRC15)，這些基因與細胞外基質的產生和細胞遷移有關。13種TAAs來源于CYP4Z1，它與許多癌癥類型有關，并在乳腺癌患者中引發自身抗體。11個TAAs與細胞增殖有關(圖4B)，其在成熟上皮細胞和血細胞中低水平表達，但在骨髓祖細胞中高水平表達(圖4A)。使用與aeTSA相同的標準來預測TCGA數據集中每個腫瘤的TAAs數量(圖4C)。結果顯示高水平TAAs的HR+和TNBC腫瘤存在免疫激活和免疫抑制通路富集，包括PI3K/mTOR、Wnt/B-catenin和MAPK通路。此外，含有大量TAAs的腫瘤顯示出成纖維細胞增殖標志物的富集。這些發現表明，在存在多種TAAs的情況下，抗腫瘤免疫反應受到免疫抑制通路的激活和CAFs的積累所調節。
5.TAS和TAAs的免疫原性
為了評估已鑒定抗原的免疫原性，作者進行了特異性T細胞功能擴增(FEST)試驗，檢測了2名健康獻血者HLA異型呈現的11種不同抗原(7種TSA和4種TAAs)(圖6)。陽性對照為免疫原修飾的MelanA drived MAP(ELAGIGILTV)和呼吸道合胞病毒RSV-NL9肽(NPKASLLSL)。結果顯示7種TSAs刺激后，TCR Vβ克隆型顯著擴增(從3個擴增到39個)，4種TAAs中有3個表現出2到37個克隆型的顯著擴增，新抗原特異性TCR克隆型的數量與抗腫瘤反應相關。這些結果顯示MAP刺激健康受試者后，免疫系統中存在多克隆且功能正常的TAAs和TSAs特異性T細胞，這些細胞對于腫瘤免疫治療的成功起著重要作用，有助于對抗腫瘤細胞。
6.TAS提高了TNBC患者的總體生存率
作者進一步評估了TAAs和aeTSAs的數量是否與TCGA患者的總生存率相關，結果顯示TAAs的數量對HR+或TNBC腫瘤患者的生存沒有影響(圖7A，B)。同樣，aeTSAs對HR+腫瘤患者也沒有影響(圖7C)。然而，在TNBC組中，aeTSAs越多，總生存率越高(圖7D)，從MAGE基因和非編碼區提取的aeTSA中也可以觀察到這種優勢，且這種影響是受HLA限制(圖7E，F)。因此可以得出結論，aeTSAs在TNBC患者可以提高生存優勢(圖7D)，而HR+腫瘤中沒有這種情況(圖7C)，可能是因為HR+腫瘤的aeTSAs比TNBC腫瘤更少(圖3C)。
結論
本文通過質譜方法及并利用蛋白組學構建個性化數據庫對14例激素受體陽性（HR+）和12例三陰性乳腺癌（TNBC）患者的MHC I相關肽進行了分析，鑒定出57094種獨特的MAPs，發現了25個TSAs和49個TAAs，這些抗原可作為癌癥免疫治療的潛在靶點，并進一步比較了TNBC和HR+乳腺癌的免疫肽組，二者表現出源基因高度重疊、mTSAs極為罕見、TAAs在兩者中大量高度共享這些相似性，也表現出免疫肽組學差異性，即aeTSA經常在TNBC中發現，但很少在HR+腫瘤中發現。這些結果對于了解免疫系統如何識別和攻擊乳腺癌細胞以及開發免疫治療策略具有重要意義。
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