你是否在為計數尺寸較小的PBMC、T細胞等而發愁？
在篩選用于輸血的紅細胞時，為避免免疫反應，對不同細胞類型進行區分尤為重要，而臺盼藍無法區分，這一問題該如何解決？
本文提供了使用熒光染料、借助高通量熒光細胞計數儀快速準確對細胞計數、鑒別的方式。

吖啶橙（AO）等熒光染料可以更準確地計數血液樣本中的白細胞，這是一項有助于對抗血癌的創新方法。
血癌——包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，通常難以治療。傳統的化療和放療療效有限，特別是在復發或對治療有抵抗的情況下容易引起嚴重的副作用。
最近出現的新療法，特別是嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法，有希望解決這些復雜的疾病。CAR-T細胞療法包括提取患者自身的免疫T細胞，對它們進行基因工程改造靶向癌細胞，然后將它們重新引入患者體內。
這種方法在治療血癌方面取得了顯著的成功。然而，要使CAR-T細胞療法充分發揮其潛力，臨床醫生需要了解每個樣品中免疫細胞的準確數量和質量。
 
自動計數
位于韓國首爾的一家名為NanoEntek的公司于2000年代初期開始研究可行的解決方案。該公司的研究人員探索了微流控技術對改善血液樣本細胞計數的潛力。
傳統方法使用臺盼藍染料，該染料僅染色死細胞。病理學家通過手動計算細胞總數，然后減去染色死細胞的數量來確定細胞活力。
然而，這種方法是費時費力的。NanoEnTek意識到需要更好的解決方案，于是開發了使用自動化細胞計數的方法。通過引入自動細胞計數儀，該公司使該過程更加一致、準確，并操作簡便。此外，通過使用自動化高通量細胞計數儀，顯著提高了細胞計數的效率。
 

細胞鑒別
隨著技術的進步，傳統方法的可靠性越來越低。這體現在進行細胞治療研究時，原代細胞、外周血單核細胞 （PBMC） 和干細胞等多種細胞類型的計數不準確。
例如，臺盼藍的顯著局限性是它無法區分紅細胞和PBMC。在篩選用于輸血的紅細胞時，對不同細胞類型進行區分尤為重要，因為白細胞的存在可能會引起受者的免疫反應。
熒光染料如AO和DAPI通過選擇性染色細胞核來克服這一限制。因此，這可以幫助研究人員和臨床醫生輕松區分具有細胞核的白細胞和缺乏細胞核的紅細胞。
此外，手動計數難以對體積小的血細胞進行準確計數。熒光染料可以克服這個問題，因為它們選擇性地對細胞核進行染色，并在顯微鏡下觀察時發出強烈的熒光。因此，它們甚至可以更精準地測量最小的細胞，如PBMC、T細胞和自然殺傷細胞，這些細胞對細胞治療至關重要。
此外，NanoEnTek的多幀成像技術可以進一步提高測量精度。“自動成像系統可以對每個樣本都采集到多張圖像，”NanoEnTek的Chan Park解釋道，“由于所有測量值都是平均的，因此精度得到了顯著提高。”
 
解決復雜問題
在處理含有污染物的樣品或可能患有污染物的患者的樣品時，基于熒光的方法非常有效。
準確的細胞計數對細胞和基因治療至關重要，正在使用NanoEnTek的熒光細胞計數儀的公司InnoBation Bio的 Beom Choi 說：“準確的活淋巴細胞數量是材料質控的一個簡單而重要的標準，”他解釋道，“如果初始密度測量不正確，一切都會分崩離析。”
免疫系統被激活而導致炎癥是傳統方法的挑戰。這可能導致淋巴細胞樣本被大量紅細胞污染，傳統方法可能會錯誤地將其計為淋巴細胞。“然而，由于紅細胞缺乏細胞核，它們不會吸收熒光染料，”Choi解釋說，“這使我們能夠準確地確定起始材料中活細胞的數量。”
冷凍是病理學實驗室的常見做法，同樣面臨著挑戰。
使用傳統的細胞計數方法時，臺盼藍會低估解凍后的死細胞數量。
美國德克薩斯州休斯頓衛理公會研究所的生物醫學工程教授Moonsoo Jin目前正在評估NanoEnTek的一種免疫表型分析儀器。他熱衷于基于熒光的方法提高精度的能力，特別是在經歷多次凍融循環的細胞治療產品中。
“基于熒光的自動化細胞計數技術滿足了對細胞準確且快速地計數，并能獲得細胞治療中需要的細胞活力的相關數據，通常需要在制造和產品發布過程中多次凍融”，Jin指出，“NanoEnTek的儀器只需要少量樣品，就可以提供準確和快速的細胞數量和活力結果。”
這種準確性、高效率和小樣本量的結合凸顯了基于熒光的細胞計數技術在細胞治療中的顯著優勢。
 

展望
NanoEnTek擴展了這種基于熒光的技術，不僅旨在區分活細胞和死細胞，還要區分各種類型的免疫細胞。這一進展與用于治療血癌的CAR-T細胞療法（同時使用T細胞和自然殺傷細胞）相關。正如Park所指出的，其目標是擴展細胞計數儀的功能，以涵蓋免疫表型分析，以適應基于細胞療法不斷變化的需求。
基于這些創新，NanoEnTek開發了能夠同時處理多達 48 個樣品的自動化的高通量細胞計數儀——EVE™ HT FL高通量熒光自動細胞計數儀。此外，與傳統方法相比，它需要的樣本量要少得多。這對于CAR-T細胞療法等研究尤其有利，因為CAR-T細胞療法只有少量可用于各種評估。“NanoEnTek將自動化系統的速度和準確性與熒光染料的特異性結合在一個設備中，”Park說，“這有望改善細胞分析，為提高生物醫學研究和治療的精度鋪平道路。”
“隨著細胞治療和基因治療的不斷擴展，從血癌擴展到實體瘤，基于熒光的細胞染色方法的應用進一步蓬勃發展，有望在更廣泛的治療環境中發揮作用。