細菌形態：

細菌可以呈現三種基本形狀之一：球形（球菌）、桿狀（芽孢桿菌）或彎曲（弧菌、螺菌）。例如，一些球菌會成對存在，大多數鏈球菌類似于一長串珠子，而葡萄球菌則形成隨機團塊（“葡萄球菌”這個名字來源于希臘語staphyle，意思是“葡萄簇”）。此外，一些球菌以方形或立方體團塊形式出現。桿菌通常單獨出現，但有些菌株會形成長鏈，例如棒狀桿菌，經常以任意角度相互連接。有些桿菌的末端是尖的，而另一些桿菌的末端是方形的。還有些桿狀桿彎曲成逗號形狀通常被稱為弧菌，包括引起霍亂的霍亂弧菌。其他形狀的細菌包括彎曲的螺旋體，形成類似于開瓶器的螺旋體。
 

圖二 革蘭氏陽性與陰性的比較（圖源網絡）

 

02細菌污染現象

細菌在適宜的條件下會快速增殖，因此細菌污染的進程一般很快，有的在培養箱過夜便可觀察到培養液渾濁，同時因為細菌的代謝產生酸性物質使培養液的pH下降變黃。在顯微鏡下，會發現細沙狀/桿狀/球狀的黑點均勻密集分布，有的甚至會產生異樣的氣味。

下面讓我們通過一些圖片來進一步具象化細菌污染吧！

圖三 左側為正常培養基顏色，右側為細菌污染后的培養基，可明顯發現變黃、渾濁。（圖源客戶）


圖四 細菌污染初期培養基粉紅色，略帶渾濁。（圖源客戶）


圖五 細菌污染可能造成細胞增殖緩慢或形態上的改變（多角、多核等），細胞質中產生空泡、細胞不附著。（圖源客戶）


圖六 細菌污染嚴重時，顯微鏡下觀察呈細沙狀，放大倍數仔細觀察可以見黑點會存在均一的細菌形態如桿狀、球狀、彎曲等。（需要區別于血清沉淀，血清沉淀通常形態不一）

03 細菌污染的防治

細菌的克星：抗生素

又稱為抗菌素，是指由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物，能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質。抗生素等抗菌劑的抑菌或殺菌作用，主要是針對“細菌有而人（或其他動植物）沒有”的機制進行殺傷，包含四大作用機理，即：抑制細菌細胞壁合成，增強細菌細胞膜通透性，干擾細菌蛋白質合成以及抑制細菌核酸復制轉錄。



抗生素的作用具有選擇性，不同抗生素對不同病原菌的作用不一樣。對某種抗生素敏感的病原菌種類稱為該抗生素的抗生譜（抗菌譜）。僅對單一菌種或屬有抗菌作用，這類抗生素稱為窄譜抗菌素，如青霉素的抗菌譜主要包括革蘭氏陽性菌和某些陰性球菌，鏈霉素的抗菌譜主要是部分革蘭氏陰性桿菌。在細胞培養中，為了起到預防的作用我們常加入1%的青鏈雙抗（C3420-0100），抗生素聯合使用目的是減少細菌耐藥性，擴大抗菌范圍。但是雙抗并不是營養體系，有研究證實抗生素會影響某些細胞的增殖和細胞代謝等，因此在無菌條件良好的情況下，無需添加。

圖七 某些抗生素的抑菌原理^[1]

想“對癥用藥”需要菌種鑒定
可以提取細菌基因組DNA，通過PCR擴增測序之后，與GeneBank或者Eztaxon對比即可。一般序列相似度在99%以上就可以認為是同一個種細菌（當然也有例外，DNA序列僅僅是一個參考指標）。常規鑒定內容有形態特征和理化特性。形態特征包括顯微形態和培養特征；理化特性包括營養類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應、酶反應和血清學反應等。


在細胞培養過程中除了添加抗生素我們應該做好以下工作

污染后處理：

●及時丟棄發生污染的細胞

●對環境進行消殺，紫外線滅菌、消毒液擦拭培養箱、工作臺等

●檢查所有用過的相關試劑是否發生污染，條件允許的情況下可以開封新試劑使用

對于重要且污染相對較輕的細胞：可以考慮先用含有5%-10%的雙抗的PBS進行多次清洗，再用含5%-10%的抗生素的培養基用藥 24h-48h小時，換液使用含有2-3%的抗生素培養基培養24h，最后再換回常規的含1%雙抗的培養液進行培養，期間要隨時觀察細胞的狀態。但需要注意的是：一旦發生污染后再使用抗生素常常難以根除，另有研究表明，高濃度抗生素可能對細胞有負面影響。

預防大于處理：

在細胞實驗過程中，我們不希望看到任何微生物污染的情況發生。為了避免浪費有限的精力和資源，應優先預防污染的發生。因此我們在細胞培養過程中需要遵循無菌技術的所有準則，包括無菌工作區、無菌試劑、良好的個人衛生和無菌處理等。當然，最最最重要的是我們要擁有足夠且正確的知識和意識，才能夠輕松應對細胞培養過程中發生的種種情形。

參考文獻：
[1] Kapoor G, Saigal S, Elongavan A. Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. 2017 Jul-Sep;33(3):300-305.
[2] Kadner, Robert J. Rogers, Kara. "bacteria". Encyclopedia Britannica, 15 Aug. 2024.