在使用Teledyne ISCO的CombiFlash^®系統(tǒng)時(shí)，或者在純化沒有色團(tuán)的化合物時(shí)，可以使用薄層色譜法（TLC）來定位收集到的餾分中的純化化合物。

如果已知化合物的保留因子（R_f），則可以根據(jù)柱體積估計(jì)含有所需物質(zhì)的餾分收集管。柱體積是裝填柱的空隙（空余）體積。這一規(guī)格在所有RediSep^®色譜柱的色譜應(yīng)用說明3中都有列出。

了解R_f和柱體積可以讓您大致了解化合物可能位于哪些餾分收集管的范圍。

二、一般方法    

將待分離的化合物加載到TLC板上，并分離成幾個(gè)種類。

控制參數(shù)    

TLC的幾個(gè)參數(shù)必須保持一致以獲得良好的相關(guān)性。

• TLC溶劑應(yīng)以體積比的方式量取，以便混合物在轉(zhuǎn)移到梯度生成系統(tǒng)時(shí)保持恒定。

• 為了獲得最佳結(jié)果，建議對(duì)層析室和板進(jìn)行平衡。

• 推薦將板運(yùn)行至距離板頂部1-4厘米以內(nèi)，以實(shí)現(xiàn)良好的分離。

• 在運(yùn)行板之前，應(yīng)標(biāo)記樣品斑點(diǎn)位置和溶劑水平。

• 應(yīng)在運(yùn)行結(jié)束時(shí)標(biāo)記溶劑洗脫高度和樣品斑點(diǎn)位置。

• 在進(jìn)行TLC時(shí)，層析室中的溶劑水平絕不能觸及樣品，并且應(yīng)覆蓋層析室以維持氣相中的平衡。

假設(shè)    

有幾個(gè)假設(shè)：

• 色譜柱和TLC板使用相同類型的固定相。

• TLC方法中使用的溶劑與液體分離中使用的溶劑相同。

因此，液體分離必須是等度洗脫。

• TLC的Rf應(yīng)小于0.5且大于0.1，如果不是這樣，則可能需要不同的溶劑系統(tǒng)。

R_f值    

R_f — 保留因子。樣品斑點(diǎn)移動(dòng)的距離。Rf通過以下公式計(jì)算：

   

Z_x — 斑點(diǎn)從其起始點(diǎn)（樣品線）移動(dòng)的距離。請(qǐng)參考圖1和圖2。

Z_f — 從原始溶劑線到最終溶劑前沿的距離。

Z₀ — 從溶劑線到樣品線的距離。

圖1：TLC起始

   

圖2：TLC完成

柱體積相關(guān)性    

一旦知道了混合物中某個(gè)組分的R_f，就可以與柱體積（CV）建立相關(guān)性。 

如果R_f值在0.1和0.5之間，它可以被輸入到以下公式中，以給出收集管的范圍。

   

Volc — 柱的空隙體積。

Volf — 每個(gè)管中收集的餾分體積。

三、示例

請(qǐng)參考圖3。

   
圖3：TLC示例

一個(gè)丙酮斑點(diǎn)洗脫了62毫米（Z_x=62毫米），溶劑水平到水平樣品線的距離是8毫米（Z₀=8毫米），溶劑前沿移動(dòng)的距離是170毫米（Z_f=170毫米）。R_f是無量綱的，所以單位被省略，進(jìn)行計(jì)算：

   

   

   

四、計(jì)算機(jī)

人們可以輕松使用Microsoft^® Excel^®或其他電子表格程序來創(chuàng)建Rf和試管相關(guān)性計(jì)算器：

   

圖4：R_f和試管相關(guān)性計(jì)算器

五、參考    

Colin F. Poole and Salwa K. Poole, “Chromatography Today”, Elsevier Science Publishers B.V., 649-667, (1991).