MP應用：定量表征蛋白質-DNA間的相互作用
蛋白質-DNA相互作用在DNA修復、復制和轉錄等活細胞調節過程中發揮著關鍵作用1。然而，使用傳統的生物分析工具研究這些相互作用時通常是比較困難的，這是因為該相互作用中涉及了高度異質復合物的形成2。質量光度法則非常適合此類相互作用體系的研究，它可以快速測量溶液中不同生物分子（例如DNA和蛋白質）的質量，并且無需標記和固定2。通過表征生物分子的質量分布，該方法詳細表征溶液中的各個蛋白質和DNA組分，他們形成的復合物，以及每種組分的相對豐度，并且也能夠定量給出相互作用體系的親和力。此外，使用Refeyn專有的新型多功能MassGlass CC 玻片，使質量光度法測定蛋白質-DNA相互作用變得更加容易（圖1）。該玻片消除了測量不同樣品需要手動修飾玻片的過程，MassGlass CC 玻片有助于在單次質量光度測量中測量實驗中的高度異質復合物，節省了用戶的時間，并且降低了不同批次實驗帶來的差異。
圖1. 不同生物分子與MassGlass CC玻片相互作用示意圖。
質量光度法需要生物分子與玻片表面發生相互作用；然而，帶有強烈負電荷的核酸分子往往被未修飾玻片排斥，這導致核酸分子與玻片的結合頻率較低，并且往往是瞬時的，這導致質量光度測定數據中的結合事件比較少，并且定義不是很準確。Mass Glass CC玻片具有陽離子表面電荷，有利于蛋白質和核酸與玻片表面的相互作用，從而可以在單次測量時同時測量蛋白質和DNA分子以及他們形成的復合物。為了展示MassGlass CC如何簡化用戶的工作流程，我們使用這些玻片進行了一系列的質量光度測定實驗，該研究涉及端粒重復結合因子2（TRF2）與雙鏈端粒DNA之間的相互作用。TRF2抑制DNA損傷反應并起到保持端粒完整性的功能3,4，這時TRF2:DNA的表征尤為重要，幫助科學家們更深入了解這些生物學過程以及他們與衰老相關疾病中端粒功能障礙的關系。使用TwoMP質量光度計和Mass Glass CC玻片，我們定量測量了參與反應的每種組分及它們形成復合物的相對豐度，并計算了該相互作用中的平衡解離常數（KD）。蛋白質-DNA相互作用的表征質量光度法非常適合研究相互作用和復合物的形成。在所展示的案例研究中，TRF2以150nM和端粒DNA以1:1的比例混合，并在室溫下孵育15分鐘，使復合物的反應達到平衡。孵育后，通過在樣品孔的原位稀釋樣品測量樣品，樣品的終濃度為15nM。結果清楚顯示了TRF2二聚體（126kDa），DNA(53kDa)以及他們相互作用形成的復合物（194kDa）（圖2）。
質量光度法定量蛋白質-DNA的相互作用親和力
為了獲得有關TRF2:DNA相互作用親和力的信息，我們使用15nM的質量光度測量數據計算了KD（圖2）.基于參考文獻5中提供的方法，假設該相互作用已達到平衡，我們根據三次質量光度測量的平均值計算了KD，得到的結果為16.5±5.1nM；而當前，相互作用親和力評估的金標準SPR獲得結果（KD=14.8nM）相比，兩種方法的結果符合的非常好，具有較高的一致性。
上圖，使用質量光度法分別測量TRF2和端粒DNA（15nM）；下圖為TRF2和端粒DNA以1:1摩爾比在150nM混合孵育，然后在15nM下使用質量光度法測量，溶液中含有以下組分：端粒DNA（53kDa），TRF2二聚體（126kDa），以及TRF2和DNA以2:1的結合比形成的TRF2-DNA復合物。需要指出的是，該測量使用蛋白質分子作為標準物質獲得標準曲線。質量光度法可用于測量任何相互作用的KD值，其中前提是結合和未結合的物質在質量光度規定的濃度下(100pM-100nM)均可觀測到。與SPR相比，質量光度法優點是，定量確定參與DNA-蛋白質相互作用的結合比和相對豐度。此外，質量光度法是無標記的分析方法，不需要將蛋白質分子固定，測量速度更快，并且用戶需要的專業知識更少。總結使用Refeyn提供的MassGlass CC即用型玻片，質量光度法用戶可以在單次測量中表征蛋白質-DNA相互作用，從而節省時間并避免批次間的差異。在此案例研究中，質量光度法能夠表征TRF2：DNA的相互作用，得到的平衡解離常數與SPR數據一致。此外，質量光度法還能獲得相互作用的結合計量學以及參與相互作用的組分以及他們在溶液中形成復合物的相對豐度。
圖1. 不同生物分子與MassGlass CC玻片相互作用示意圖。質量光度法需要生物分子與玻片表面發生相互作用；然而，帶有強烈負電荷的核酸分子往往被未修飾玻片排斥，這導致核酸分子與玻片的結合頻率較低，并且往往是瞬時的，這導致質量光度測定數據中的結合事件比較少，并且定義不是很準確。Mass Glass CC玻片具有陽離子表面電荷，有利于蛋白質和核酸與玻片表面的相互作用，從而可以在單次測量時同時測量蛋白質和DNA分子以及他們形成的復合物。為了展示MassGlass CC如何簡化用戶的工作流程，我們使用這些玻片進行了一系列的質量光度測定實驗，該研究涉及端粒重復結合因子2（TRF2）與雙鏈端粒DNA之間的相互作用。TRF2抑制DNA損傷反應并起到保持端粒完整性的功能3,4，這時TRF2:DNA的表征尤為重要，幫助科學家們更深入了解這些生物學過程以及他們與衰老相關疾病中端粒功能障礙的關系。使用TwoMP質量光度計和Mass Glass CC玻片，我們定量測量了參與反應的每種組分及它們形成復合物的相對豐度，并計算了該相互作用中的平衡解離常數（KD）。蛋白質-DNA相互作用的表征質量光度法非常適合研究相互作用和復合物的形成。在所展示的案例研究中，TRF2以150nM和端粒DNA以1:1的比例混合，并在室溫下孵育15分鐘，使復合物的反應達到平衡。孵育后，通過在樣品孔的原位稀釋樣品測量樣品，樣品的終濃度為15nM。結果清楚顯示了TRF2二聚體（126kDa），DNA(53kDa)以及他們相互作用形成的復合物（194kDa）（圖2）。
質量光度法定量蛋白質-DNA的相互作用親和力
為了獲得有關TRF2:DNA相互作用親和力的信息，我們使用15nM的質量光度測量數據計算了KD（圖2）.基于參考文獻5中提供的方法，假設該相互作用已達到平衡，我們根據三次質量光度測量的平均值計算了KD，得到的結果為16.5±5.1nM；而當前，相互作用親和力評估的金標準SPR獲得結果（KD=14.8nM）相比，兩種方法的結果符合的非常好，具有較高的一致性。
圖2. 質量光度法定量溶液中蛋白質，DNA和蛋白質-DNA復合物的質量分布和相對豐度。
上圖，使用質量光度法分別測量TRF2和端粒DNA（15nM）；下圖為TRF2和端粒DNA以1:1摩爾比在150nM混合孵育，然后在15nM下使用質量光度法測量，溶液中含有以下組分：端粒DNA（53kDa），TRF2二聚體（126kDa），以及TRF2和DNA以2:1的結合比形成的TRF2-DNA復合物。需要指出的是，該測量使用蛋白質分子作為標準物質獲得標準曲線。質量光度法可用于測量任何相互作用的KD值，其中前提是結合和未結合的物質在質量光度規定的濃度下(100pM-100nM)均可觀測到。與SPR相比，質量光度法優點是，定量確定參與DNA-蛋白質相互作用的結合比和相對豐度。此外，質量光度法是無標記的分析方法，不需要將蛋白質分子固定，測量速度更快，并且用戶需要的專業知識更少。總結使用Refeyn提供的MassGlass CC即用型玻片，質量光度法用戶可以在單次測量中表征蛋白質-DNA相互作用，從而節省時間并避免批次間的差異。在此案例研究中，質量光度法能夠表征TRF2：DNA的相互作用，得到的平衡解離常數與SPR數據一致。此外，質量光度法還能獲得相互作用的結合計量學以及參與相互作用的組分以及他們在溶液中形成復合物的相對豐度。
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