介紹
新的單細胞技術促進了健康組織和癌癥中異質細胞群的分析。單細胞全基因組測序可以研究腫瘤和健康組織的克隆結構和遺傳變異，并且可以通過單細胞轉錄組學確定不同的細胞類型或細胞狀態的變化。然而，基因組數據本身依賴于先驗知識來理解任何表型效應。相反，轉錄組數據可以說是衡量細胞表型的一種敏感指標，但其本身并不能揭示這種變異的根本原因。

最近，來自瑞典卡羅林斯卡研究所的Martin Enge教授及其同事報告了直接核標記和 RNA測序（DNTR-seq，Zachariadis 等人2020）的發展，這是一種聯合測序來自同一單細胞基因組 DNA 和 mRNA 以確定基因型對表型直接影響的方法。雖然已經發表了其他聯合單細胞 mRNA 和 DNA 測序的方法，但它們的規模化成本高得令人望而卻步，需要專門的設備，或者存在技術偏差，限制了它們的采用。我們分享一個使用 DNTR-seq的低成本實驗方案，無需專用設備，生成覆蓋均勻且技術偏差低的 DNA 文庫，并實現與黃金標準、單模態方法同等質量的 mRNA 文庫。通過將 MANTIS®液體處理器與其他液體處理儀器結合使用，我們能夠在一天內對 1500 個細胞進行多路復用和制備 DNA 和 RNA 文庫。在本應用筆記中，我們將展示如何使用 MANTIS 執行 DNTR-seq 并概述該系統的一些優勢。

實驗方案
DNTR-seq是一種基于微孔板的多組學方法，其精確步驟在protocols.io網站上進行了描述。分離感興趣的組織并使用FACS分選器進行細胞分離，其中單細胞被分選到 384 孔板中。輕輕裂解細胞膜并進行離心步驟。然后輕輕吸入胞質溶膠，將其轉移到另一個微孔板中。這實現了細胞核和胞質溶膠的物理分離。每個部分都可以未經處理地存儲，這使得實驗設計具有靈活性。

mRNA 測序基于Smart-Seq2，其中包括許多可以在 MANTIS 上以快速準確的方式執行的分配步驟。首先，將Oligo(dT)引物與mRNA退火，然后進行逆轉錄和 PCR 預擴增，然后進行 PCR 純化、標記、PCR 和測序。全基因組測序基于直接標記，使用過度活躍的 tn5 轉座子系統。此時，我們進行蛋白酶消化以從核蛋白中釋放基因組 DNA。然后通過轉座消化基因組 DNA，轉座裝載 Illumina 測序兼容的寡核苷酸，這些寡核苷酸通過PCR擴增添加。這樣我們就不需要執行任何有損清理程序，直接標記方法最大限度地減少了位置偏差，使該方法成為調用拷貝數變異 (CNV) 的理想方法。

基因組和轉錄組測序的實驗方案都包括非常適合MANTIS的分配步驟。我們將重點介紹三種使用 MANTIS 降低成本的方法，即節省時間、節省試劑和最大限度地減少塑料消耗。

使用MANTIS的時間效率
我們系統的分液體積范圍為1μL到20μL，因此事實證明，能夠在小容量芯片（0.1 或0.5 μL 試樣）和大容量芯片（1或5μL 試樣）之間自由選擇非常有用。使用MANTIS，我們能夠在不到 3 分鐘的時間內將1μL液滴分配到384孔板的每個孔中，并在大約8分鐘內移液20μL（圖 1）。

圖 1. 分液時間

因為可以在胞質溶膠解凍或從細胞核分裂3分鐘后設置逆轉錄，所以這不僅大大增加了實驗室中的多路復用能力，而且還減少了我們必須處理mRNA的時間。因此，最大限度地減少RNA降解的機會。使用裂解緩沖液制備微孔板也是如此，因為我們在裂解緩沖液中加入了ERCC RNA Spike-In (External RNA Controls Consortium) 。

使用MANTIS最大限度地減少試劑浪費
我們在 DNTR-seq 實驗方案中同時使用 FORMULATRIX® 的低容量和高容量芯片。當使用低容量芯片時，我們使用移液器吸頭為儲液器裝載試劑，而當我們使用高容量芯片時，我們通過基于管道的儲液器裝載試劑。在制備一塊微孔板時（圖2），我們實驗室的兩種典型分配體積--20μL（使用高容量芯片）和 1.5μL（使用低容量芯片）--的不可恢復死體積分別僅為 4% 和 5.5%（圖 2）。

圖2. 試劑使用

通常，我們一次處理四塊微孔板，由于我們不需要為每塊微孔板充注芯片，因此不可回收的死體積下降到所制備試劑總體積的1%以下。

使用MANTIS最大限度地減少塑料消耗
在沒有MANTIS的情況下處理 384 孔板需要大量的移液器吸頭。通過使用 MANTIS執行分配步驟，當我們需要復制微孔板和條形碼時，除了胞質溶膠和細胞核部分之間的分離之外，我們無需使用吸頭。實驗方案中的一些試劑，如標記混合物和SDS，由于它們的一致性，使其難以移液，因此，即使可以進行非接觸式分液，也需要我們在手動移液時經常切換吸頭。換用MANTIS后，我們節省了10盒用于處理一塊DNA實驗板和一塊RNA實驗板（384個細胞）的吸頭。這為 384 個細胞的 DNTR-seq 檢測節省了 130 多歐元。 

通過使用MANTIS，我們生成了兩種模式的高質量庫（圖 3）。

圖 3. 在 Agilent TapeStation 上運行的成功 DNA（頂部）和 RNA（底部）DNTR-seq 文庫的概況。

MANTIS能夠快速移液，無需使用吸頭，且材料浪費少，因此非常適用于DNTR-seq（一種高度可擴展、靈活、基于板的方法）等方案。