以大腸桿菌中細(xì)菌人工染色體（BAC）的檢測為例，我們進(jìn)行了菌落PCR，然后進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳。本次實(shí)驗(yàn)的DNA引物是使用Kilobaser個人DNA和RNA合成儀制備的，并與從Eurofins訂購的DNA引物進(jìn)行了比較。
 

1 介紹
細(xì)菌人工染色體
質(zhì)粒通常用于將 DNA 片段轉(zhuǎn)染到細(xì)菌中。然而，質(zhì)粒的使用在處理長度約為 15,000 bp 的大 DNA 片段時會達(dá)到極限。與質(zhì)粒相比，BAC（如 pBelobac11）可以容納大小高達(dá) 300,000 bp 的 DNA 片段。

例如，這種方法在人類基因組計(jì)劃中用于對人類的整個 DNA 進(jìn)行測序。為此，將人類 DNA 切成隨機(jī)部分并整合到 BAC 中。由于 BAC 包含保守的 DNA 片段，因此在轉(zhuǎn)染到細(xì)菌后很容易檢測這些片段。從含有 BAC 的細(xì)菌菌落中提取 DNA 并進(jìn)行桑格測序。

菌落 PCR
菌落 PCR 繞過了通常至關(guān)重要的從細(xì)菌中提取 DNA 或 RNA 的過程。這提供了一種更快且更不容易出錯的替代方法來檢測和擴(kuò)增特定的 DNA 或 RNA 片段。在菌落 PCR 中，單個細(xì)菌菌落被稀釋到無菌水中，并將其中的一份直接添加到 PCR 反應(yīng)中。

KILOBASER DNA 合成
Kilobaser 個人 DNA & RNA 合成儀是一款臺式微柱合成儀。其技術(shù)基于試劑盒系統(tǒng)與微流控芯片相結(jié)合。

標(biāo)準(zhǔn) DNA 引物在 Kilobaser 合成后無需純化。由于試劑消耗量低，鹽殘留量可忽略不計(jì)。引物合成后溶于水中，可立即使用。為了合成本應(yīng)用中使用的 DNA 引物，使用了一個 Kilobaser 標(biāo)準(zhǔn) DNA 試劑盒和 6 個 Kilobaser 標(biāo)準(zhǔn)芯片。

2 材料與方法
DNA 引物的制備
為了驗(yàn)證細(xì)菌中是否仍含有細(xì)菌人工染色體，利用Kilobaser個人DNA合成儀合成特異性引物，使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒和6個標(biāo)準(zhǔn)微流體芯片。

•   hV-UL30-FP, ATCAACTTCGACTGGCCCTT

•   hV-UL30-RP, CCGTACATGTCGATGTTCAC

•   gC-FP, TCACCATGGAGTTTACGGGC

•   gC-RP, GTACTCGGTCTGCTCGTACG

•   UL6-FP, GACCTCAGCAAGTCCATGGA

•   UL6-RP, GGCGCAGAATCTTGAAGCAG

合成后，將 DNA 引物懸浮于 30 µL 無核酸酶水中，渦旋 2 分鐘。使用 QubitTM (ThermoFisher) 確定引物濃度 (300 pmol)。

菌落 PCR
接下來，我們對單個大腸桿菌菌落進(jìn)行菌落 PCR。將其在 300 µL 高壓滅菌去離子水中無菌稀釋。將 1 µL 等分試樣轉(zhuǎn)移到 50 µL PCR 反應(yīng)中。

50 µL 菌落 PCR 反應(yīng)混合物

•   1 µL 正向引物 (Kilobaser / eurofins)

•   1 µL 反向引物 (Kilobaser / eurofins)

•   1 µL 稀釋的單個大腸桿菌菌落

•  25 µL Dream Taq PCR 主混合物 (Thermo Fisher)

•   無核酸酶水至 50 µL

熱循環(huán)概況

• 95°C 1.5 分鐘

• 38 次 95°C 30 秒，53°C 30 秒，72°C 1 分鐘

• 72°C 10 分鐘

• 然后將 PCR 片段放在 1% 瓊脂糖凝膠上，并根據(jù)大小分離

3 結(jié)果
我們預(yù)期的DNA片段長度如下：

•  UL30 – 179 bp

•   gC – 197 bp

•   UL6 – 142 bp

圖 1 顯示了透射儀上得到的瓊脂糖凝膠。使用 100 bp 標(biāo)準(zhǔn)梯度，我們可以看到 UL30 剛好低于 200 bp 標(biāo)記，正如預(yù)期的那樣。與 UL6 引物匹配的 DNA 片段也顯示出預(yù)期的大小。gC 片段比預(yù)期的要大得多，在這里我們可以假設(shè)引物設(shè)計(jì)不良或退火溫度不匹配。盡管如此，至少有一個 DNA 片段表明一個結(jié)合引物。PCR 反應(yīng)在所有比較中都顯示出片段長度和強(qiáng)度沒有差異。
 

圖 1 用于檢測大腸桿菌中人工細(xì)菌染色體的菌落 PCR 瓊脂糖凝膠。從左到右的條帶描述為：100 bp 梯狀條帶、帶有 Eurofins(E) 引物的 UL30、帶有 Kilobaser(K) 引物的 UL30、Lambda-Hind 梯狀條帶、帶有 Eurofins 引物的 gC、帶有 Kilobaser 引物的 gC、帶有 Eurofins 引物的 UL6、帶有 Kilobaser 引物的 UL6。

使用 Kilobaser 合成引物和從在線合成供應(yīng)商 (Eurofins) 訂購的引物進(jìn)行的 PCR 產(chǎn)物的片段長度和強(qiáng)度沒有差異。

4 結(jié)論
我們已經(jīng)證明所選的細(xì)菌菌落含有 BAC。因此，可以提取并測序該菌落中的 DNA。
需要重新設(shè)計(jì) gC DNA 片段的引物，因?yàn)橹辽僖粋�引物未與目標(biāo)序列結(jié)合。
此外，我們已經(jīng)證明使用 Kilobaser 個人 DNA 和 RNA 合成器合成的 DNA 引物與從合成提供商在線訂購的引物產(chǎn)生相同的結(jié)果。