阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease, AD）是最為常見的神經退行性疾病。內質網應激（ER-stress）被認為是導致AD的一項重要的病理機制。中腦星形膠質細胞源性神經營養因子（Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF）是一種非典型神經營養因子，并且MANF的表達在ER stress條件下會顯著升高。之前的研究成果顯示MANF對于ER stress導致的細胞損傷起到保護作用，然而這些研究均基于急性的ER stress。AD作為一種病理進程緩慢的神經退行性疾病，持續性的ER stress及其對應的MANF長時間高表達對于細胞功能所產生的影響仍不清楚。

2024年10月18日，暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院楊甦團隊在Molecular neurodegeneration期刊（一區Top，IF 14.9）在線發表題為“Increased expression of mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) contributes to synapse loss in Alzheimer’s disease”的論文。研究團隊發現AD病程中伴隨的MANF過表達會導致突觸蛋白表達水平下降和突觸數量減少。其分子機制是MANF影響RNA結合蛋白ELAVL2對突觸相關mRNA穩定性的調控。在AD小鼠模型中增加或降低MANF的表達會相應的加劇或緩解AD病理表型。這些結果提示MANF的異常表達是導致AD病理發生發展的重要因素。暨南大學博士研究生張怡然、陳秀生和陳來強為論文的共同第一作者；楊甦研究員為通訊作者。
 

研究材料
在此項研究中，研究人員使用了腦內過表達MANF的轉基因小鼠（由賽業生物構建），5xFAD小鼠和APP/PS1小鼠。

技術方法
研究人員使用了小鼠行為學、腦立體定位注射、CRISPR基因編輯技術、分子生物學、免疫組化、免疫共沉淀等多種技術手段。

技術路線

1. 檢測AD小鼠和患者腦內MANF蛋白表達
2. MANF轉基因小鼠的行為學和神經突觸檢測
3. MANF影響突觸形成的機制研究
4. 驗證AD小鼠腦內改變MANF表達對AD病程的影響

研究結果
1. 檢測AD小鼠和患者腦內MANF蛋白表達
研究團隊利用5xFAD小鼠檢驗MANF蛋白的水平，發現海馬體內MANF的表達隨年齡增加而升高，且伴有突觸蛋白減少。該現象在AD患者的海馬體內也得到了驗證（圖1）。進一步研究發現，MANF的表達與β-Amyloid的累積（β-Amyloid burden）呈正相關，與突觸蛋白的表達呈負相關。
 

圖1. 5xFAD小鼠和AD患者的海馬體內MANF表達增加

2. MANF轉基因小鼠認知功能異常
研究團隊利用腦內過表達MANF的轉基因小鼠開展行為學實驗（該小鼠模型由賽業生物構建）。發現MANF轉基因小鼠的學習和記憶能力下降、焦慮水平上升。電生理實驗顯示MANF轉基因小鼠的海馬體神經元功能異常（圖2）。這些結果提示MANF過表達會影響海馬體神經元的功能進而導致小鼠行為異常。

圖2. MANF過表達導致小鼠的學習和記憶功能下降

3. MANF轉基因小鼠的神經突觸丟失
研究團隊檢測了MANF轉基因小鼠的突觸蛋白表達，發現該小鼠海馬體內突觸后蛋白PSD95和突觸前囊泡蛋白synaptophysin都顯著減少。通過免疫熒光染色和高爾基染色顯示神經突觸數量顯著減少（圖3）。說明MANF過表達導致海馬體內神經突觸減少，這可能是影響小鼠學習和記憶功能的原因。
 

圖3. MANF過表達導致海馬體內神經突觸丟失

4. MANF調控突觸功能的分子機制
研究團隊通過蛋白質組學和轉錄組學分析，找到了MANF的互作蛋白——與學習和記憶功能密切相關的RNA結合蛋白ELAVL2。MANF過表達會影響ELAVL2與下游突觸相關mRNA的結合，進而影響相關基因的表達（圖4）。這些結果揭示了MANF影響神經突觸數量和功能的機制。
 

圖4. MANF通過與ELAVL2結合影響突觸相關基因表達

5. 敲低MANF表達緩解AD表型
研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯工具在5xFAD小鼠的海馬體內敲低MANF的表達，發現MANF表達降低不影響β-Amyloid的累積，但是顯著緩解了小鼠的行為學異常和突觸丟失（圖5）。從而提示MANF可能是治療AD的潛在靶點。
 

圖5. 在5xFAD小鼠海馬區中敲低MANF的表達減輕了突觸丟失和行為學異常

總結
綜上所述，本研究首次發現MANF在AD小鼠海馬體表達升高會導致神經突觸丟失和認知功能下降，并且揭示了該現象背后的潛在分子機制。本研究通過MANF將ER-stress與AD病理聯系起來，驗證了敲低MANF緩解AD病理表型的可能性，為AD的治療提供了潛在的新靶點。