研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
人腦研究的瓶頸與組織透明化技術(shù)進展
人腦研究面臨倫理、法律及樣本獲取的多重限制，而嚙齒動物模型難以完全模擬人類疾病特征。組織透明化技術(shù)通過降低組織折射率實現(xiàn)三維成像，已在動物模型中廣泛應用（如iDISCO+、FDISCO、MACS）。其中，CLARITY技術(shù)保留蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的同時去除脂質(zhì)，大多數(shù)關(guān)于CLARITY技術(shù)的研究集中在固定的嚙齒動物腦組織上，對于人類大腦樣本的研究相對較少。盡管已有部分研究嘗試將組織透明化技術(shù)應用于人類大腦，以探究人類發(fā)育異常大腦、阿爾茨海默病、路易體病和自閉癥等疾病的發(fā)病機制，但這些研究樣本缺乏在透明化時間、偽影以及染色效率等方面的定量比較。此外，在抗體染色方法的選擇和比較上，相關(guān)研究也較為匱乏，而抗體染色通常被認為是人類腦組織透明化研究的主要瓶頸。

X-CLARITY™技術(shù)的優(yōu)化目標
提高組織透明化效率：減少透明化所需時間，使新鮮樣本達到80%透明度的平均時間從4小時進一步縮短，遺體樣本從40小時大幅減少，同時提升透明度質(zhì)量，降低樣本腫脹程度和殘留污漬，增強樣本處理效果。

降低樣本處理成本：簡化操作流程，減少實驗步驟和所需試劑，降低時間和經(jīng)濟成本，使研究人員能更高效、低成本地使用該技術(shù)處理大量樣本。

減少偽影干擾：通過改進處理方法，降低因自發(fā)熒光和激光散射產(chǎn)生的偽影，尤其是減少尸體樣本中的偽影數(shù)量和分散度，提高成像清晰度和準確性，避免偽影對研究結(jié)果的誤判。

增強抗體染色效果：優(yōu)化染色條件，提高抗體穿透深度，使染色更均勻、穩(wěn)定，實現(xiàn)更多種類蛋白質(zhì)的有效染色。

擴大樣本適用性：從目前主要針對人腦皮層小樣本，拓展到適用于大腦不同區(qū)域、不同類型的組織樣本，同時更好地處理新鮮樣本和尸體樣本，減少樣本差異對實驗結(jié)果的影響。

技術(shù)創(chuàng)新與應用
樣本的精心選取與處理
新鮮樣本均在死后80小時內(nèi)收集，暫存于4°C環(huán)境，之后將大腦皮層中央溝周圍的部分組織在4%多聚甲醛（PFA）中固定1周，再轉(zhuǎn)移至含0.02%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液中保存。遺體樣本大腦皮層組織塊在4% PFA中固定超過1年，實驗前同樣浸泡在溶液中。

X-CLARITY™技術(shù)的巧妙運用
研究人員選用X-CLARITY™技術(shù)對組織樣本進行透明化處理。首先，將組織塊手工切成約1毫米厚的切片，在水凝膠中孵育1天。對于新鮮樣本，前期樣本切片較厚，后期樣本則借助1毫米網(wǎng)格精確切成1毫米厚。隨后，使用X-CLARITY™聚合系統(tǒng)進行3小時聚合反應。聚合完成后，組織塊用PBS洗滌3小時，再進行X-CLARITY™透明化處理，直至樣本達到理想的透明效果。

多元染色方法的探索與比較
為了找到最佳染色方法，研究團隊對比了三種染色方案：4天染色法（4DS）、11天染色法（11DS）和使用商業(yè)試劑盒的4天染色法（4DS-C）。在4天染色法方法中，預處理后的樣本先在含抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體的溶液中孵育4天后洗滌2天，再在其他溶液中孵育4天，最后洗滌2天。11天染色法方法與4天染色法步驟相似，只是一抗和二抗的孵育時間均延長至11天。商業(yè)試劑4天染色法方法則先在透化緩沖液中浸泡2天，接著在含GFAP抗體的試劑盒染色緩沖液中孵育4天，洗滌后再在試劑盒染色緩沖液中孵育4天，最后洗滌2天。

成像與數(shù)據(jù)分析的科學流程
成像前，樣本需在封片劑中浸泡4小時，以實現(xiàn)折射率的均勻化。共聚焦顯微鏡使用405nm、488nm和594nm的激光激發(fā)波長，搭配10倍物鏡和20倍物鏡進行圖像采集。利用Zen Blue、LAS X和Imaris軟件對圖像進行可視化和三維渲染處理，以便更直觀地觀察樣本結(jié)構(gòu)。

在數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)，研究人員借助ImageJ軟件進行多項指標的量化分析。通過計算樣本透明前后的不透明度，評估透明化效率；將樣本中自發(fā)熒光和激光散射產(chǎn)生的偽影與圖像亮度關(guān)聯(lián)，量化偽影水平；依據(jù)GFAP抗體熒光亮度估算染色抗原的含量；以DAPI信號亮度衡量DAPI染色效率。

成像實驗與結(jié)果分析
兩種樣本透明化效率大比拼研究人員利用X-CLARITY™技術(shù)對兩種樣本進行透明化處理，并詳細
記錄了透明化效率隨時間的變化。結(jié)果顯示，隨著透明化時間的增加，兩種樣本的透明化效率（即透明度）均呈非線性上升趨勢（不透明度下降）。新鮮樣本平均僅需4小時就能達到80%的透明度，而遺體樣本則需要40小時，此外，透明化處理后，兩種樣本均出現(xiàn)了腫脹現(xiàn)象，綜合來看，新鮮樣本在透明化時間和質(zhì)量方面均優(yōu)于遺體樣本。

兩種樣本偽影差異顯著
偽影會嚴重干擾熒光圖像的采集，影響研究結(jié)果的準確性。研究人員對比了透明化14小時的新鮮樣本和遺體樣本的偽影情況，發(fā)現(xiàn)遺體樣本的偽影更為明顯，且分布更為分散。進一步通過ImageJ軟件量化分析發(fā)現(xiàn)，新鮮樣本的偽影與不透明度呈一定相關(guān)性，而遺體樣本的相關(guān)性較弱。即使在相似的不透明度范圍內(nèi)，遺體樣本的偽影數(shù)量也顯著多于新鮮樣本。這表明新鮮樣本產(chǎn)生的偽影明顯少于遺體樣本，更有利于后續(xù)的成像觀察。

DAPI染色在新鮮樣本中更具優(yōu)勢
DAPI作為一種能高效穿透組織并對核酸進行染色的納米級化學染料，其在不同孵育時間下的染色深度在人腦樣本中尚未得到精確研究。研究人員對人類大腦皮層進行不同時長的DAPI染色實驗，發(fā)現(xiàn)當孵育時間超過16小時時，DNA染色深度可超過500μm。而且，隨著孵育時間的延長，不僅染色深度增加，樣本表面的熒光亮度也有所提高。對比新鮮樣本和遺體樣本的DAPI染色效果，發(fā)現(xiàn)1毫米厚的遺體組織樣本在染色4天后，幾乎沒有DAPI染色信號（僅有自發(fā)熒光），即使使用30μm厚的切片也未觀察到染色；而新鮮樣本在3D透明化的30μm切片中則有明顯的DAPI染色。這充分說明DAPI在新鮮樣本中的染色效率更高。

GFAP染色在兩種樣本中表現(xiàn)相近
研究人員采用4天染色法方法，使用抗體對透明化后的新鮮樣本和遺體樣本進行染色，以比較二者的GFAP染色效率。結(jié)果顯示，在相同的透明化時間或相同的透明化效率下，新鮮樣本和遺體樣本的GFAP染色效果相似。這表明在GFAP染色方面，新鮮樣本和遺體樣本的表現(xiàn)相近。

4DS-C染色方法脫穎而出
研究人員對4DS、11DS和4DS-C三種染色方法進行全面比較，評估指標涵蓋染色時間、抗體穿透深度、方法復雜度、組織污染程度和成本，結(jié)果表明，4DS-C方法的抗體染色深度最深。在方法復雜度方面，4DS-C方法借助商業(yè)試劑盒，操作相對簡便，組織污染程度較低，染色后產(chǎn)生的可見偽影較少。因此，4DS-C方法在三種染色方法中表現(xiàn)最為出色。

3D成像呈現(xiàn)大腦微觀結(jié)構(gòu)之美
借助優(yōu)化后的組織透明化技術(shù)和4天染色方法，研究人員成功獲取了人類大腦的3D圖像。使用凝集素作為染色染料，能夠清晰呈現(xiàn)血管及其復雜的分支結(jié)構(gòu)。利用抗GFAP抗體，則可觀察到結(jié)構(gòu)極為復雜的人類大腦星形膠質(zhì)細胞。通過組合GFAP染色（顯示星形膠質(zhì)細胞）、DAPI染色（顯示細胞核）和凝集素染色（顯示血管），還構(gòu)建出了人類大腦的復合圖像。

總結(jié)與展望
該研究優(yōu)化的腦組織透明化和成像方法，是腦科學研究的有力技術(shù)支撐。用新鮮樣本和4DS-C染色法，能清晰觀察大腦三維微觀結(jié)構(gòu)，助力了解大腦正常發(fā)育和疾病時的結(jié)構(gòu)變化，為揭示大腦奧秘打基礎，像研究阿爾茨海默病時可助于探索發(fā)病機制。此技術(shù)在腦部疾病診療上潛力巨大，可幫助醫(yī)生精準識別病變組織微觀特征，提升早期診斷率。治療方面，依據(jù)大腦結(jié)構(gòu)變化設計針對性方案，如針對帕金森病開發(fā)神經(jīng)修復療法。但未來還需優(yōu)化染色方案、擴大樣本范圍、增加樣本量、改進成像技術(shù)，有望開發(fā)更優(yōu)透明化技術(shù)和染色方法，結(jié)合單細胞測序等技術(shù)，從多層面解析大腦奧秘，推動腦科學發(fā)展。  

論文信息
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。

Kim MS, Ahn JH, Mo JE, Song HY, Cheon D, Yoo SH, Choi HJ. Optimizing tissue clearing and imaging methods for human brain tissue. J Int Med Res. 2021 Mar;49(3):3000605211001729.

DOI:10.1177/03000605211001729.