在生物醫(yī)學(xué)的微觀探索之旅中，我們一直渴望能夠深入了解生物分子在三維空間中的精妙布局。如今，開發(fā)了一種結(jié)合拉曼染料和組織透明化的多色三維成像技術(shù)（RADIANT），實(shí)現(xiàn)了在毫米厚度的腦組織切片中一次性成像11種分子組分，把多色成像的深度提升了10到100倍。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
生物系統(tǒng)是復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)在其中的分布和相互作用對理解生命過程至關(guān)重要，比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在多種神經(jīng)元亞型，單個(gè)神經(jīng)元延伸廣泛，研究蛋白質(zhì)在大體積組織中的分布意義重大。熒光顯微鏡是常用的蛋白質(zhì)成像技術(shù)，但因其熒光光譜過寬，存在“顏色屏障”，一般同時(shí)成像目標(biāo)不超5個(gè)。高度多重化蛋白質(zhì)成像技術(shù)雖能增加成像目標(biāo)數(shù)量，卻大多只能用于薄樣本，像循環(huán)免疫熒光技術(shù)，在厚組織成像時(shí)面臨諸多難題，如染色時(shí)間長、抗原損失、結(jié)構(gòu)損傷以及圖像配準(zhǔn)困難等。拉曼成像雖理論上可突破熒光限制，但靈敏度欠佳。盡管提升了拉曼成像靈敏度，卻受組織光散射影響，成像深度受限。因此，開發(fā)能在深層組織中實(shí)現(xiàn)高度多重化成像的技術(shù)迫在眉睫。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
拉曼成像的潛力與挑戰(zhàn)
拉曼光譜的振動峰極為狹窄，與熒光光譜相比，分辨率更高。這一特性使得拉曼成像在理論層面具備突破熒光成像“顏色壁壘”的能力，有望實(shí)現(xiàn)對多種分子的精準(zhǔn)區(qū)分與成像。例如，不同分子在拉曼光譜中具有各自獨(dú)特的振動峰，如同每個(gè)人獨(dú)特的“分子指紋”，通過對這些振動峰的識別，能夠準(zhǔn)確鑒定不同分子。

當(dāng)拉曼成像技術(shù)應(yīng)用于生物樣本時(shí)，諸多挑戰(zhàn)接踵而至。生物體內(nèi)分子濃度復(fù)雜多樣，拉曼成像的靈敏度相對較低，難以有效檢測低濃度的生物分子。同時(shí)，生物組織猶如一道屏障，對拉曼信號存在強(qiáng)烈的散射和吸收作用。這不僅嚴(yán)重影響成像質(zhì)量，還極大地限制了成像深度，使得拉曼成像在深層組織成像方面舉步維艱。盡管科研人員通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件、開發(fā)新探針以及結(jié)合其他技術(shù)提升了其靈敏度，但深層組織成像難題依舊存在，成為阻礙拉曼成像技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

RADIANT技術(shù)的原理與優(yōu)勢
為攻克這些難題，RADIANT技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)巧妙融合拉曼染料和組織透明化技術(shù)，成為深層生物組織多色成像的創(chuàng)新解決方案。其核心之一是新型拉曼染料——MARS染料。MARS染料具備在拉曼靜默區(qū)成像的獨(dú)特能力，有效避開了傳統(tǒng)拉曼染料在指紋區(qū)成像時(shí)易受組織透明化試劑干擾的問題。同時(shí)，它能夠通過免疫標(biāo)記的方式，精準(zhǔn)地與目標(biāo)生物分子特異性結(jié)合，為研究人員定位和檢測目標(biāo)分子提供了有力工具。

組織透明化技術(shù)在RADIANT技術(shù)中也起著舉足輕重的作用。傳統(tǒng)組織透明化方法主要服務(wù)于熒光顯微鏡，并不完全適用于拉曼成像。研究人員經(jīng)過系統(tǒng)研究與優(yōu)化，篩選出適配MARS染料的組織透明化技術(shù)，并進(jìn)一步改進(jìn)開發(fā)出rDISCO技術(shù)。rDISCO技術(shù)通過降低透明化溫度、添加抗氧化劑等手段，顯著提高了MARS染料成像的信噪比，使得在深層組織中獲取高質(zhì)量成像成為可能。

與傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，RADIANT技術(shù)優(yōu)勢明顯。它成功打破“顏色壁壘”，在小鼠小腦薄切片上實(shí)現(xiàn)12色成像，極大地豐富了成像信息。其成像深度提升了10-100倍，可對毫米厚度的腦組織切片進(jìn)行成像，讓科研人員能夠深入探索組織內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)。此外，RADIANT技術(shù)的免疫標(biāo)記和成像步驟一次完成，所獲圖像天然具備三維配準(zhǔn)效果，無需復(fù)雜的配準(zhǔn)校正過程，大大提高了成像效率與準(zhǔn)確性，為生命科學(xué)研究開辟了全新視角，助力科研人員更深入地探索生物微觀世界的奧秘。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
拉曼染料與組織透明化的兼容性研究
在RADIANT技術(shù)研發(fā)中，拉曼染料與組織透明化試劑的兼容性至關(guān)重要。組織透明化試劑的高濃度化學(xué)物質(zhì)在拉曼光譜指紋區(qū)會產(chǎn)生干擾信號。研究人員測試傳統(tǒng)拉曼染料和MARS染料后發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)拉曼染料受干擾嚴(yán)重，無法清晰成像；而MARS染料在拉曼靜默區(qū)成像，能避免干擾，可穩(wěn)定標(biāo)記目標(biāo)生物分子，為RADIANT技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

MARS染料的擴(kuò)展與多色成像
為提升成像能力，研究人員拓展MARS染料，經(jīng)篩選確定8種性能良好的染料。結(jié)合4種熒光染料，利用免疫標(biāo)記法在小鼠小腦薄切片上實(shí)現(xiàn)12色成像。成像時(shí)，先處理小鼠小腦組織，再用標(biāo)記不同染料的抗體染色，通過拉曼和熒光成像技術(shù)，可同時(shí)觀察多種生物分子分布，像神經(jīng)元核標(biāo)記物NeuN、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP等，展示了小腦組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間關(guān)系，體現(xiàn)MARS染料多色成像優(yōu)勢。

組織透明化方法的篩選與優(yōu)化
研究人員以MARS染料成像信噪比為標(biāo)準(zhǔn)，對多種組織透明化技術(shù)進(jìn)行篩選。此前基于尿素的技術(shù)為保脂質(zhì)犧牲透明效果，不適用于RADIANT技術(shù)。經(jīng)測試，3DISCO和uDISCO表現(xiàn)突出。深入研究發(fā)現(xiàn)，uDISCO因試劑配方能更好保護(hù)MARS染料，減少過氧化物對其分解，成像質(zhì)量更優(yōu)。基于此，研究人員利用uDISCO實(shí)現(xiàn)500微米厚腦組織切片一次性8色三維成像，突破厚樣品“顏色壁壘”，便于深入研究腦組織微觀結(jié)構(gòu)。

rDISCO的開發(fā)與性能提升
考慮到MARS染料對過氧化物敏感，研究人員改進(jìn)uDISCO技術(shù)可進(jìn)一步提升信噪比。rDISCO技術(shù)在uDISCO基礎(chǔ)上，其提供的信噪比在整個(gè)成像深度范圍內(nèi)約是uDISCO的2倍。對1毫米厚度腦組織切片成像顯示，rDISCO技術(shù)成像更清晰準(zhǔn)確，為RADIANT技術(shù)廣泛應(yīng)用提供有力支持。

毫米級組織的一次性多重成像
借助rDISCO技術(shù)，研究人員成功實(shí)現(xiàn)1毫米厚度腦組織切片一次性11色成像。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先對切片免疫標(biāo)記，用rDISCO技術(shù)透明化處理，再進(jìn)行拉曼和熒光成像。這種一次性成像避免傳統(tǒng)循環(huán)免疫熒光技術(shù)的配準(zhǔn)校正難題，保證圖像質(zhì)量。獲得的11色三維圖像清晰展示腦組織不同細(xì)胞類型和生物分子分布，有助于研究人員探究其分布規(guī)律和作用機(jī)制，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究等提供新思路和方法。

多維度信息的提取與分析
RADIANT技術(shù)不僅成像出色，還能多維度分析成像數(shù)據(jù)。在圖像分割上，依據(jù)生物分子標(biāo)記信息可識別不同細(xì)胞類型和組織結(jié)構(gòu)；空間相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中波形纖維蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白在小腦白質(zhì)強(qiáng)相關(guān)，暗示其協(xié)同作用；細(xì)胞類型組成分析通過兩種蛋白表達(dá)分割出不同分化程度星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其與血管距離分布不同，與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能相符；三維距離分析揭示不同分化程度細(xì)胞與血管距離差異，反映其功能和發(fā)育階段特點(diǎn)；網(wǎng)絡(luò)分析計(jì)算蛋白中心性，發(fā)現(xiàn)β-Ⅲ微管蛋白在小腦浦肯野層中心性高，暗示其對浦肯野細(xì)胞的重要性。

總結(jié)與展望
RADIANT技術(shù)意義非凡。技術(shù)上，突破傳統(tǒng)成像局限，實(shí)現(xiàn)厚組織多目標(biāo)超分辨率成像，提高成像深度，為觀察生物分子三維分布及相互作用提供有力工具。生物學(xué)研究中，有助于揭示生物發(fā)育分子機(jī)制，如小腦發(fā)育研究。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可輔助疾病診斷與病理研究，為腫瘤診療等提供關(guān)鍵信息。不過該技術(shù)也存在局限。成像深度和染色均勻性依賴樣本，成像速度慢，通量受二抗和探針限制。未來可利用促進(jìn)運(yùn)輸技術(shù)提升成像深度和染色效果，借助原位信號放大技術(shù)提高成像速度，引入新探針并驗(yàn)證一抗文庫增加成像通量，還可拓展至RNA和DNA成像。隨著技術(shù)完善，RADIANT有望在構(gòu)建組織圖譜、腫瘤研究和腦電路分析等領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Shi L, Wei M, Miao Y, Qian N, Shi L, Singer RA, Benninger RKP, Min W. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nat Biotechnol. 2022 Mar;40(3):364-373. 

DOI:10.1038/s41587-021-01041-z.