傳統(tǒng)藥物研發(fā)多聚焦于可成藥的一小部分蛋白質(zhì)家族，而人類基因組序列轉(zhuǎn)錄出的RNA分子中，超過98%為不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA（ncRNA）。這些 ncRNA 在細胞進程中意義重大，其失調(diào)或變異與多種疾病相關(guān)，如癌癥和神經(jīng)退行性疾病等。因此，ncRNA 成為極具潛力的藥物靶點。核糖核酸酶P（RNase P）是一種廣泛存在且必不可少的酶，通過剪切5'端前導(dǎo)序列以催化前體tRNA 的成熟。在核糖核蛋白（RNP）形式的RNase P 中，RNA 亞基（RPR）具有催化活性，其結(jié)構(gòu)在不同生命域中既有保守的催化核心，又有多樣化的外周元件，這種結(jié)構(gòu)多樣性、必要性和低拷貝數(shù)的特點，使 RNase P 成為理想的藥物靶點。過去已有諸多研究嘗試開發(fā)其抑制劑，如氨基糖苷類及其衍生物、亞甲藍等酚噻嗪類衍生物，以及通過高通量篩選（HTS）發(fā)現(xiàn)的 iriginol hexa-acetate 和 purpurin 等。但這些抑制劑普遍存在問題，如氨基糖苷類和酚噻嗪類是混雜結(jié)合劑，對目標 RNA 選擇性低；iriginol hexa-acetate 和 purpurin 雖能抑制細菌 RNase P，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其抑制作用是導(dǎo)致細菌 RPP聚集，并非直接作用于 RPR。因此，尋找新型、有效的RNase P抑制劑迫在眉睫。

 

文章題目為“Use of a small molecule microarray screen to identify inhibitors of the catalytic RNA subunit of Methanobrevibacter smithii RNase P”于2024年11月發(fā)表在Nucleic Acids Research雜志，作者來自于美國國家癌癥研究所。

研究對象為原核生物甲烷細菌（Msm），其廣泛存在于腸道中且與多種疾病有關(guān)。作者首先將Msm RPR 克隆到pBT7質(zhì)粒表達載體中，并生成 5'-3'延伸變體，通過 T7 RNA 聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成RNA，將其存儲在- 20°C 備用。

隨后使用英國ArrayJet生物芯片點樣儀將購買的7300種化合物點印到玻片上，形成高密度化合物微陣列，使用PBST緩沖液清洗后，孵育Cy5標記的Msm RPR以及對照buffer，結(jié)果通過法國Innopsys的熒光掃描儀 InnoScan 1100 AL 進行掃描分析（激發(fā)波長635 nm），發(fā)現(xiàn)只有在高濃度的Mg²⁺作用下，RPR才具有活性，并從中篩選出48種特異性結(jié)合的小分子化合物，其大多數(shù)是二芳基哌替啶類及其類似物（如圖1）。

圖1：圖A玻片分別孵育對照buffer、cy5-oligo、Msm樣品（不同濃度Mg²⁺處理）結(jié)果圖；圖B結(jié)果統(tǒng)計圖

在發(fā)現(xiàn)的48種化合物中有22種可以直接商品化購買，隨后對其進行Msm RPR活性分析，結(jié)果顯示只有化合物 M1和M10有抑制效果，分別抑制30%和12%。同時，通過結(jié)構(gòu)設(shè)計和優(yōu)化對M1進行高純度合成，對商品M1comm和合成品M1syn進行抑制常數(shù)的分析比對，兩次實驗取均值得KI值分別為49±13和17±1 μM，合成品的純度高其抑制效果更好（如圖2）。

圖2:圖A 22種小分子化合物的抑制效果統(tǒng)計圖；圖B商品M1 兩次重復(fù)實驗抑制常數(shù)統(tǒng)計結(jié)果；圖C、D合成M1不同濃度的抑制效果以及兩次重復(fù)實驗的抑制常數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

隨后對合成的M1與 Msm RPR進行表面等離子共振成像（SPRi）的結(jié)合親和力檢測，即在Plexera普芯生物具有光交聯(lián)表面化學(xué)修飾的SPRi芯片上制備微陣列，將M1及其類似物（10mM溶解于DMSO溶液）以8×8 陣列打印到芯片表面，每個化合物重復(fù)打印3次。打印后，芯片在真空黑暗環(huán)境下干燥8小時，再用 365nm紫外線照射15分鐘，然后依次用DMSO、甲醇和去離子水洗滌，并組裝到流動池中，將不同濃度的Msm RPR（0.156-20 μM）作為流動相注入流動池，進行動力學(xué)檢測，設(shè)定結(jié)合時間為300秒，解離時間為300秒，流速2μL/s。利用Plexera SPR數(shù)據(jù)分析軟件和GraphPad Prism 10進行親和力分析，發(fā)現(xiàn)小分子化合物M1，能夠抑制Msm RPR的活性，測得結(jié)合常數(shù)為8 ± 3 μM。

本研究發(fā)現(xiàn)二芳基哌啶化合物M1對 Msm RPR具有良好的抑制作用，且對其結(jié)構(gòu)類似的Pfu RPR無抑制效果，展現(xiàn)出良好的選擇性。這不僅為深入研究Msm RPR的功能和作用機制提供了有力工具，也為開發(fā)針對Msm RPR的特異性抑制劑奠定了基礎(chǔ)。此外，通過對合成M1類似物進行結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）分析，明確了M1中關(guān)鍵功能基團對抑制活性的影響，為后續(xù)優(yōu)化抑制劑結(jié)構(gòu)、提高抑制活性提供了理論依據(jù)。利用小分子微陣列（SMM）篩選技術(shù)和非標記動力學(xué)檢測（SPRi）技術(shù)，成功鑒定出與Msm RPR結(jié)合的小分子，證明了該技術(shù)在篩選與識別小分子的有效性，為RNA靶向藥物研發(fā)提供了新的技術(shù)手段和思路。通過 SMM 篩選，可以更高效地從大量化合物中篩選出潛在的RNA結(jié)合分子，有助于發(fā)現(xiàn)更多針對結(jié)構(gòu)化RNA的小分子抑制劑，進一步推動RNA靶向藥物的發(fā)展。

 

原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae1190

 

Arrayjet位于英國愛丁堡，專注于提供生物芯片應(yīng)用領(lǐng)域的解決方案及服務(wù)。自2000年公司成立即致力于開發(fā)新型生物樣品噴點方案–噴墨式液體處理平臺，該系統(tǒng)于2006年上市，目前用戶遍布全球27個國家。

 

Mercury系列產(chǎn)品采用獨特的飛行噴墨點樣技術(shù)實現(xiàn)行業(yè)第一的快速、非接觸式微量液體處理。同時上萬種不同樣品可以進行快速點樣，專利的上樣模塊配合高通量的點樣噴頭保障您的點樣操作快速、無污染，更低的上樣體積可有效減少樣品損失，使您的珍貴樣品物盡其用。該系列產(chǎn)品制備高密度的蛋白微陣列芯片、抗體微陣列芯片、糖微陣列芯片、小分子化合物微陣列芯片等，用于自身免疫抗體、生物標記物、候選疫苗或靶點的高通量篩選，疾病研究和新藥研發(fā)等諸多科研和臨床領(lǐng)域。

普芯生物，源于美國Lumera（2003年成立）生物檢測部，2009年P(guān)lexera 成立，致力于研發(fā)無標記高通量SPRi系統(tǒng)和芯片藥物篩選技術(shù)，2018年推出第一代PlexArray HT 并不斷迭代，2023底年正式推出由蘇州普芯在國內(nèi)自主研發(fā)、國內(nèi)硬件生產(chǎn)和組裝同時重新設(shè)計軟件系統(tǒng)的PlexArray HT Ultra系列。

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