雙光子成像應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的最新趨勢
在生物醫(yī)學研究的前沿領(lǐng)域，雙光子自發(fā)熒光壽命成像（2P-FLIM）技術(shù)正以其獨特的優(yōu)勢，為科學家們提供了一種全新的視角。這種技術(shù)通過測量熒光分子的壽命，而非傳統(tǒng)的熒光強度，為我們揭示了細胞代謝、分子相互作用以及疾病進程中的深層次信息。2P-FLIM技術(shù)的非侵入性、高分辨率和對復雜生物環(huán)境的適應(yīng)性，使其在癌癥研究、神經(jīng)科學、傳染病和傷口愈合等多個領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。
研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
細胞代謝與熒光成像
細胞代謝是維持生命活動的核心過程，涉及能量產(chǎn)生、物質(zhì)合成和信號傳導等多個方面。傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)雖然能夠提供細胞結(jié)構(gòu)和功能的可視化信息，但其對細胞代謝的動態(tài)變化缺乏敏感性。此外，熒光成像中的背景信號干擾和光漂白現(xiàn)象也限制了其在深層次組織中的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種能夠非侵入性地監(jiān)測細胞代謝變化的技術(shù)，對于生物醫(yī)學研究具有重要意義。
熒光壽命成像的優(yōu)勢
熒光壽命成像技術(shù)通過測量熒光分子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的平均時間（即熒光壽命），提供了一種獨立于熒光強度的新型成像參數(shù)。熒光壽命不受熒光分子濃度、光漂白和光學路徑的影響，使其成為研究細胞內(nèi)化學環(huán)境變化的理想工具。2P-FLIM技術(shù)通過雙光子激發(fā)，進一步提高了成像的深度穿透能力和空間分辨率，為活體組織的高分辨率成像提供了可能。
技術(shù)挑戰(zhàn)
盡管2P-FLIM技術(shù)具有諸多優(yōu)勢，但在實際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，熒光壽命的測量需要高靈敏度的探測器和復雜的信號處理算法，這增加了設(shè)備的成本和操作難度。其次，生物樣本中的多種熒光分子可能在同一像素內(nèi)共存，導致數(shù)據(jù)解釋的復雜性。此外，熒光壽命的測量對光子計數(shù)的要求較高，這在自熒光樣本中可能難以實現(xiàn)。
技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
雙光子激發(fā)與數(shù)據(jù)處理
2P-FLIM技術(shù)結(jié)合了雙光子激發(fā)和時間相關(guān)單光子計數(shù)技術(shù)（TCSPC），實現(xiàn)了對深層組織的高分辨率成像。雙光子激發(fā)通過同時吸收兩個光子使熒光分子激發(fā)，這種激發(fā)方式限制了熒光發(fā)射主要發(fā)生在焦點區(qū)域，從而減少了背景信號干擾。TCSPC技術(shù)通過測量熒光衰減曲線，精確計算熒光壽命，為研究分子相互作用和代謝變化提供了新的手段。
在傳染病研究中，2P-FLIM技術(shù)被用于分析病毒和細菌感染對細胞代謝的影響。例如，在丙型肝炎病毒（HCV）感染的研究中，2P-FLIM技術(shù)通過測量細胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小變化，揭示了HCV核心蛋白D2對細胞代謝的調(diào)控機制。研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染導致細胞內(nèi)NAD(P)H的熒光壽命顯著縮短，表明自由和蛋白結(jié)合型NAD(P)H的比例發(fā)生了變化。這些發(fā)現(xiàn)為理解病毒感染的代謝機制提供了新的視角。
在神經(jīng)科學研究中的應(yīng)用
2P-FLIM技術(shù)在神經(jīng)科學研究中展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢。通過測量神經(jīng)元中NADH的熒光壽命，研究人員能夠?qū)崟r監(jiān)測細胞的能量代謝狀態(tài)。例如，在帕金森病模型研究中，2P-FLIM技術(shù)通過分析MPP+處理的PC12細胞中NADH和FAD的熒光壽命變化，揭示了線粒體功能障礙與神經(jīng)退行性病變之間的關(guān)系。此外，2P-FLIM技術(shù)還被用于研究阿爾茨海默病（AD）小鼠模型中大腦皮層的代謝變化，為早期診斷和治療提供了潛在的生物標志物。
成像實驗與結(jié)果分析
代謝變化的可視化
在一系列實驗中，2P-FLIM技術(shù)成功地可視化了細胞代謝的變化。例如，在對大腸桿菌感染的3T3細胞進行成像時，研究人員觀察到NADH的熒光壽命顯著縮短，表明細胞代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解。這種代謝重編程與細菌感染引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。此外，在研究沙眼衣原體感染時，2P-FLIM技術(shù)首次在高分辨率下揭示了病原體與宿主細胞代謝途徑之間的直接聯(lián)系。
蛋白質(zhì)相互作用的分析
2P-FLIM技術(shù)結(jié)合福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），為研究蛋白質(zhì)相互作用提供了強大的工具。通過測量供體熒光壽命的變化，研究人員能夠?qū)崟r監(jiān)測蛋白質(zhì)間的相互作用。例如，在研究神經(jīng)元中Ras蛋白的活性時，2P-FLIM技術(shù)通過優(yōu)化的高靈敏度傳感器，成功捕捉到了Ras蛋白在小細胞區(qū)域內(nèi)的動態(tài)變化。這種能力為理解信號傳導途徑在神經(jīng)活動中的調(diào)控機制提供了新的視角。
在傷口愈合研究中，2P-FLIM技術(shù)通過測量NADH和FAD的熒光壽命，提供了傷口代謝活動的實時監(jiān)測手段。研究表明，在傷口愈合的早期階段，炎癥區(qū)域的代謝活動顯著增強，表現(xiàn)為NADH的熒光壽命增加。隨著愈合過程的推進，代謝活動逐漸恢復正常。此外，通過結(jié)合二次諧波生成（SHG）成像，研究人員還能夠觀察到膠原蛋白的動態(tài)變化，為評估傷口愈合的質(zhì)量提供了新的指標。
總結(jié)與展望
雙光子自發(fā)熒光壽命成像（2P-FLIM）技術(shù)以其非侵入性、高分辨率和對細胞代謝變化的敏感性，正在改變生物醫(yī)學研究的格局。從傳染病到神經(jīng)退行性疾病，再到癌癥和傷口愈合，2P-FLIM技術(shù)為科學家們提供了一個全新的視角來探索生命的奧秘。盡管該技術(shù)在設(shè)備成本和操作復雜性方面仍面臨挑戰(zhàn)，但隨著顯微技術(shù)的不斷進步和數(shù)據(jù)分析算法的優(yōu)化，2P-FLIM技術(shù)有望在臨床診斷和治療監(jiān)測中發(fā)揮更大的作用。2P-FLIM技術(shù)的發(fā)展方向?qū)⒓性谔岣叱上袼俣取⒃鰪娦盘栰`敏度以及與其他成像技術(shù)的融合。此外，將2P-FLIM技術(shù)與其他先進的顯微技術(shù)（如受激拉曼散射成像和超分辨顯微鏡）相結(jié)合，有望實現(xiàn)對生物分子相互作用的多維度、高分辨率成像。這些創(chuàng)新將為生物醫(yī)學研究帶來新的突破，為疾病的早期診斷、治療效果評估和機制研究提供更強大的工具。
論文信息
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。
Ranawat H, Pal S, Mazumder N. Recent trends in two-photon auto-fluorescence lifetime imaging (2P-FLIM) and its biomedical applications. Biomed Eng Lett. 2019 Jul 1;9(3):293-310.
DOI:10.1007/s13534-019-00119-7.
