方案摘要：在一定培養條件下能發酵乳糖，產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。本方法利用RAYPA培養基自動分裝儀快速制備實驗所需的培養液、蛋白胨水以及無菌水等，保持無菌環境、控制溫度避免瓊脂凝固，以提升計數的準確性和操作效率。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       大腸菌群在固體培養基中發酵乳糖產酸，在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色帶有或不帶有沉淀環的菌落，培養基自動分裝儀通過無菌環境控制、精準定量、溫度維持、自動化操作等原理，解決了大腸桿菌平板計數法中人工操作的痛點（如污染風險高、效率低、誤差大），尤其適用于實驗室的高通量檢測需求。其核心價值在于通過技術手段提升計數結果的準確性、重復性和操作效率，同時降低實驗人員的勞動強度。
 
二、實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
①  恒溫培養箱：36 ℃ ±1℃。
②  冰箱：2 ℃~5 ℃。
③  恒溫水浴箱：46℃±1℃。
④  天平：感量 0.1 g。
⑤  均質器。
⑥  振蕩器。
⑦  無菌吸管：1 mL(具 0.01 ml 刻度)、10 mL(具 0.1 ml 刻度)或微量移液器及吸頭。
⑧  無菌錐形瓶：容量 500 mL。
⑨  無菌培養皿：直徑 90 mm。
⑩  pH計或pH比色管或精密pH試紙。
⑪  自動菌落計數儀SHASHIN KAGAKU，PSF-2100。
⑫  蠕動泵分液器：fluidot  600D
⑬  電動移液器  pipetty 10mL
⑭  RAYPA培養基自動分裝儀
 
 
2、培養基和試劑
① 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( lauryl sulfate tryptose，LST)肉湯。
② 煌綠乳糖膽鹽( brilliant green lactose bile，BGLB)肉湯。
③ 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂( violet red bile agar，VRBA)。
④ 無菌磷酸鹽緩沖液。
⑤ 無菌生理鹽水。
⑥ 1 mol/L NaOH 溶液。
⑦ 1 mol/L HCl溶液。
 
 
三、檢驗程序
1、大腸菌群平板計數法的檢驗程序如下：
 
 
 
四、實驗步驟
1、樣品稀釋
 固體和半固體樣品：稱取 25g樣品，放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內 ，8000 r/min~10 000 r/min 均質1 min~2 min，或放人盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min~2 min，制成1：10 的樣品勻液。
液體樣品：以無菌吸管吸取 25 mL，樣品置盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖，充分混勻，制成1：10 的樣品勻液。
2、樣品勻液的pH應在 6.5~7.5之間，必要時分別用1 mol/L， NaOH 或1 mol/L HCl調節。
3、使用Pipetty電動移液器吸取1：10 樣品勻液1mL沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支1 mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。
4、根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。
5 、選取2個~3 個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
6、及時將 15 mL~20 mL融化并恒溫至 46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂( VRBA)約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL~4 mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。
7、選取菌落數在15 CFU~150 CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落(如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5 mm或更大，最低稀釋度平板低于15 CFU 的記錄具體菌落數。
 
8、從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養 24h~48 h，觀察產氣情況。凡 BGLB肉湯管產氣即可報告為大腸菌群陽性。

五、結果及報告
        經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例：10-'樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：100x6/10X10'/g(mL)=6.0X10’CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。