脂質體的基本結構、合成組分及主要技術
脂質體（Liposome）是一種由磷脂等兩性分子自發形成的封閉囊泡結構，隨著納米技術、材料科學等多學科的交叉發展，脂質體的研究與應用進入了一個新的階段，并在腫瘤研究、疫苗研發、基因遞送等多個領域發揮著關鍵作用。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產物、熒光染料、多肽、靶點蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻專利引用。
一、脂質體的基本結構
脂質體的基本結構是由磷脂分子在水相中自發聚集形成的雙分子層結構。磷脂分子具有親水的頭部和疏水的尾部，親水頭部朝向外部水相，而疏水尾部相互靠近形成內部疏水區域。這種結構使得脂質體的內部能夠包裹水溶性活性物，同時也能將脂溶性物質嵌入雙分子層中。
二、合成脂質體的關鍵組分
合成脂質體的關鍵組分主要包括天然或合成的脂質、多糖、固醇以及表面活性劑。
圖1. 合成脂質體的主要材料[1]
1.合成脂質
合成脂質，即非天然存在或來源于化學合成的脂質，它們在生物學和結構上與天然脂質相似，具有高生物相容性和較高的純度。合成脂質常用于構建各種響應性或具有其它特殊功能的脂質體（例如溫敏性脂質體），以及用于構建DNA/RNA相關的轉染和遞送載體。
·DLin-MC3-DMA
DLin-MC3-DMA （MC-3，RV-28，AbMole，M9382）是一種可電離的陽離子脂質。其結構特點如下：其頭部含有1個叔胺基團（pKa≈6.5），在生理pH下呈中性，在酸性內體環境中質子化帶正電；尾部包含兩個由亞油酸組成的疏水長鏈，具有較強的膜融合能力；在頭尾部之間是一個由短碳鏈（C3）組成的連接基團，用于平衡親疏水性質。DLin-MC3-DMA是一種siRNA的高效載體，對多種細胞均具有較高的轉染效率。此外，DLin-MC3-DMA還可用于mRNA疫苗的負載和在動物體內的遞送。
·SM-102
SM-102（AbMole，M22501）是一種可電離的陽離子脂質，廣泛應用于脂質體，特別是核酸及mRNA疫苗遞送相關脂質體的合成。SM-102的結構由親水且帶正電荷的頭部、連接基團和一個疏水的尾部組成。其頭部在酸性環境中可以質子化，形成正電荷，從而與帶負電荷的核酸（如mRNA）通過靜電作用結合。此外，SM-102在脂質納米顆粒中能夠引起內涵體膜不穩定，有助于脂質納米顆粒從內涵體中逃逸，從而提高藥物或基因的遞送效率。
·C12-200
C12-200（AbMole，M22499）是一種在生物醫學研究領域有重要用途的可電離陽離子類脂質和輔助脂質。C12-200是一種高效的mRNA運輸載體，能有效封裝相應的mRNA并使其進入細胞質內，C12-200還可用于合成脂質納米顆粒，并作為siRNA或CRISPR的遞送系統。
·ALC-0159
ALC-0159（AbMole，M49795）是一種PEG化的脂質賦形劑，廣泛應用于脂質體的合成，尤其是在mRNA疫苗的研發中。ALC-0159自帶的PEG鏈能夠顯著增加納米粒子在體內的循環時間。通過PEG化修飾可以減少脂質體的蛋白質吸附，減少免疫系統對納米粒子的識別和清除。ALC-0159的存在可以減少納米顆粒表面的免疫原性，這種特性使得ALC-0159在mRNA疫苗的遞送中表現出色。
·Surfactin
Surfactin（表面活性素，AbMole，M9921）是一種由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產生的環狀脂肽類表面活性劑，Surfactin具有很強的表面活性，能夠降低脂質體表面的張力，從而增強脂質體的穩定性。其環狀結構和親水性頭部使其能夠嵌入脂質體的磷脂雙層中，形成穩定的界面。
·DOTAP（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-三甲基銨丙烷）
DOTAP（AbMole，M9810，1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane）是一種陽離子脂質，其帶的正電荷由分子結構中的三甲基氨基團提供。DOTAP的正電荷使其能夠與帶負電荷的DNA或RNA形成復合物，保護核酸免受核酸酶的降解，并通過內吞作用被細胞攝取，從而實現基因的高效轉染。
·DPPC（二棕櫚酰磷脂酰膽堿）
DPPC（AbMole，M14369，1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）具有較高的相變溫度（41℃），在低于相變溫度時，它以液晶凝膠相存在，分子排列較為緊密；當溫度升高至相變溫度以上時，轉變為液晶相，分子的流動性增加。基于以上特性，DPPC常被用于構建溫敏性脂質體。
·DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿）
DOPC（AbMole，M10119，1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）屬于磷脂酰膽堿類化合物，其分子結構由一個膽堿基團、一個磷酸基團、一個甘油骨架以及兩條油酰基脂肪酸鏈組成。DOPC中的不飽和脂肪酸鏈（油酰基）使得脂質體在生理溫度下保持較高的流動性。DOPC可以與陽離子脂質（如DOTAP）混合，形成復合物，用于基因轉染。
·DSPC（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿）
DSPC（AbMole，M10121，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine）具有長的飽和脂肪鏈，可形成穩定的脂雙層結構并提高脂質體的穩定性。DSPC的脂肪酸鏈比DPPC長，這使得DSPC的分子更大，相變溫度更高。DSPC廣泛用于mRNA疫苗的載體，具有較長的體內半衰期。
·DOPE（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺）
DOPE（AbMole，M9951，1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）的脂肪酸鏈是不飽和的（含有雙鍵），這使得DOPE的分子更靈活，相變溫度更低。DOPE更適合用于構建需要高流動性的脂質體遞送載體，如基因轉染。
·DLinDMA（1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙烷）
DLinDMA（AbMole，M14954， 1,2-dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropane）是一種可電離的陽離子脂質，其結構可以分為三個主要區域：疏水的烴鏈、連接鏈和頭部基團，其結構中包含一個可質子化的叔胺基團。由DLinDMA合成的脂質體可用于siRNA遞送。此外，DLinDMA廣泛用于多種脂質體納米顆粒的構建，并作為遞送載體，在mRNA疫苗、基因、化合物等生物活性物質的遞送等領域表現出重要的應用前景。
·CKK-E12
CKK-E12（AbMole，M22498）是一種新型的脂質材料，具有良好的生物相容性和穩定性。CKK-E12的分子結構包含兩個油酸鏈（C18:1）和一個可質子化的叔胺頭部。CKK-E12具有可電離的性質，常與其他脂質結合構成脂質納米顆粒。CKK-E12具有 pH 敏感性，在低 pH 值下帶正電，有較強的核酸結合能力，而在血液 pH 值（pH7.4）下大部分不帶電，因此具有較長的循環時間。此外，CKK-E12 在體內實驗中對肝細胞具有高度選擇性，因此在肝臟研究中具有獨特優勢。
·DOTMA
DOTMA（AbMole，M10137，N,N-Dioleoyl-N,N-dimethylamidinium）也是一種陽離子脂質，可用于封裝多種核苷酸分子，并用于體外基因轉染。DOTMA 通過自身攜帶的正電荷，促進脂質體與細胞膜的有效相互作用。含有DOTMA的脂質體具有良好的膜融合特性，能夠與細胞膜高效融合，將包裹的分子釋放到細胞內部。
2.天然脂質和其他天然組分
在實驗中常用于合成脂質體的天然組分主要有磷脂、鞘脂、甾醇、多糖、固醇等幾個大類。
·磷脂
天然磷脂是動物細胞膜中最常見的組分之一，也是合成脂質體的核心成分。常用于合成脂質體的天然磷脂主要包括卵磷脂（Phosphatidylcholine，PC，AbMole，M3163）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol, PI，AbMole，M30027）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE，AbMole，M18150）等[2]。上述天然磷脂可以經過進一步修飾，進而具有更好的穩定性或其他特性，例如，磷脂酰乙醇胺（PE）通常通過胺基與聚乙二醇綴合以增加脂質體的生物相容性，保持穩定性。
·甾醇
甾醇有三種亞型：植物甾醇、動物甾醇和真菌甾醇，它們分別存在于植物、動物和微生物中。膽固醇是一種內源性兩親性動物甾醇，是哺乳動物細胞膜的重要組成部分。在細胞膜內，膽固醇（Cholesterol，AbMole，M2516）主要存在于脂筏中，它在調節膜完整性和脂筏功能的過程中發揮重要作用[3]。 脂質體制劑中膽固醇的摻入已被證明可增加體內穩定性并降低了脂質雙層的泄漏。與缺乏膽固醇的對照組相比，脂質體制劑中加入20%-50%的膽固醇后，體內穩定性增加[4, 5]。除此之外，提取自酵母細胞中的麥角甾醇（Ergosterol，AbMole，M4304）可用作膽固醇的替代品，尤其是在需要避免動物來源成分的情況下，它能夠調節脂質體膜的流動性和穩定性[4]。
·多糖
多糖在細胞通訊中發揮著重要作用，它們存在于細胞膜中，參與細胞和組織的識別過程以及某些轉運機制。用寡糖或多糖包被脂質膜可以將脂質體靶向特殊的細胞受體或延長體內循環。多糖具有額外的特性，使其非常適合用于構建脂質體，例如抗病毒、抗細菌和抗腫瘤特性。脂質體制劑中常用到的多糖是殼聚糖（Chitosan，AbMole，M9632）和透明質酸（Hyaluronic Acid，AbMole，M25431）[6]。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學用于動物體內實驗，相關科研成果發表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。
3.表面活性劑
表面活性劑是一種可降低其所結合的液體的表面張力的分子，是脂質體合成過程中關鍵的添加劑之一。脂質體合成中較常用到的表面活性劑主要有以下幾類：膽酸鈉（Cholic acid sodium，AbMole，M14359）、司盤60（Span 60，AbMole，M42810）、吐溫80（Tween 80，AbMole，M50248）。上述表面活性劑常用于對脂質體進行改性，以便脂質體實現對特殊內容物的負載。例如使用具有正電位的膽酸鈉與帶負電荷的成分（如DNA）結合。表面活性劑的類型和濃度可用于提高脂質體的包封和遞送效率[7]。
三、合成脂質體的主要技術
合成脂質體的主要方法有多種，每種方法都有其獨特的操作步驟和適用場景。以下是幾種常見的脂質體合成方法的概述：
1.薄膜分散法（Thin Film Hydration）
薄膜分散法是制備脂質體的經典方法。首先，將脂質溶解在有機溶劑（如氯仿或乙醚）中，然后通過旋轉蒸發或氮氣吹干的方式在容器壁上形成均勻的薄膜。隨后，加入適量的水相（如生理鹽水或緩沖液）使薄膜水化，形成多層脂質體。為了獲得更小且均勻的脂質體，通常需要進一步的處理，如超聲處理或通過微孔膜擠出。
2.乙醇注入法（Ethanol Injection）
乙醇注入法是一種快速制備脂質體的方法。將脂質溶解在乙醇中，然后將此溶液快速注入到含有水相的攪拌容器中。乙醇的快速擴散導致脂質分子在水相中迅速聚集形成脂質體。此方法的優點是操作簡單且無需有機溶劑的蒸發，但需要控制乙醇的注入速度和攪拌條件，以避免脂質體的過度聚集。
3.逆相蒸發法（Reverse Phase Evaporation）
逆相蒸發法適用于制備負載水溶性活性物質的脂質體。首先，將脂質溶解在有機溶劑中，然后加入含有要負載的生物活性物質的水相，形成水包油乳液。通過旋轉蒸發去除有機溶劑，形成脂質體。此方法的優點是能夠將水溶性化合物包載在脂質體的水相中，但操作相對復雜，需要精確控制蒸發條件。
4.超聲法（Ultrasonication）
超聲法是通過超聲波的機械作用來制備脂質體。將脂質溶解在有機溶劑中，蒸發形成薄膜后，加入水相使薄膜水化。然后，利用超聲波的能量使脂質體分散成更小的尺寸。此方法的優點是能夠制備較小且均勻的脂質體，但需要注意超聲時間和功率，以避免脂質體的破裂。
5.擠出法（Extrusion）
擠出法是制備均勻脂質體的有效方法。首先，通過薄膜分散法或其他方法制備出粗脂質體，然后將脂質體溶液通過聚碳酸酯膜或其他類型的擠出膜進行擠出。通過多次擠出，可以得到尺寸均一的脂質體。此方法的優點是能夠精確控制脂質體的尺寸，適合大規模生產。
脂質體合成的常用材料：
- 名稱 中文名稱 目錄號
- ALC-0159 M49795
- C12-200 M22499
- Ceramide 神經酰胺 M58114
- Chitosan 殼聚糖 M9632
- Cholesterol 膽固醇 M2516
- Cholic acid sodium 膽酸鈉 M14359
- CKK-E12 M22498
- DLinDMA 1,2 -二油酰基-3-二甲基氨基丙烷 M14954
- DLin-MC3-DMA 1,2 -二亞油基-sn-甘油-3-二甲基氨基丙基 M9382
- DOPC 1,2 -二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿 M10119
- DOPE 1,2 -二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺 M9951
- DOTAP 1,2 -二油酰基-sn-甘油-3-三甲基銨丙烷 M9810
- DPPC 二棕櫚酰磷脂酰膽堿 M14369
- DSPC 1,2- 二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿 M10121
- Ergosterol 麥角甾醇 M4304
- Hyaluronic Acid 透明質酸 M25431
- Phosphatidylcholine 卵磷脂 M3163
- Phosphatidylethanolamine 磷脂酰乙醇胺 M18150
- Phosphatidylinositol 磷脂酰肌醇 M30027
- Phosphatidylserine 磷脂酰絲氨酸 M10255
- SM-102 M22501
- Span 60 司盤60 M42810
- Span 80 司盤80 M50244
- Sphingomyelin 鞘磷脂 M49452
- Sphingosine 鞘氨醇 M20681
- Surfactin 表面活性素 M9921
- Tween 80 吐溫80 M50248
參考文獻
[1] LARGE D E, ABDELMESSIH R G, FINK E A, et al. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application [J]. Advanced drug delivery reviews, 2021, 176: 113851.
[2] VAN DER VEEN J N, KENNELLY J P, WAN S, et al. The critical role of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine metabolism in health and disease [J]. Biochimica et biophysica acta Biomembranes, 2017, 1859(9 Pt B): 1558-72.
[3] GOLUSZKO P, NOWICKI B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells [J]. Infection and immunity, 2005, 73(12): 7791-6.
[4] KIRBY C, CLARKE J, GREGORIADIS G. Effect of the cholesterol content of small unilamellar liposomes on their stability in vivo and in vitro [J]. The Biochemical journal, 1980, 186(2): 591-8.
[5] YANG T, CUI F D, CHOI M K, et al. Liposome formulation of paclitaxel with enhanced solubility and stability [J]. Drug delivery, 2007, 14(5): 301-8.
[6] PEER D, MARGALIT R. Tumor-targeted hyaluronan nanoliposomes increase the antitumor activity of liposomal Doxorubicin in syngeneic and human xenograft mouse tumor models [J]. Neoplasia (New York, NY), 2004, 6(4): 343-53.
[7] EL MAGHRABY G M, WILLIAMS A C, BARRY B W. Interactions of surfactants (edge activators) and skin penetration enhancers with liposomes [J]. International journal of pharmaceutics, 2004, 276(1-2): 143-61.
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