Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation

Keywords: anti-inflammatory phenotype; inhibition, mechanical loading; macrophage polarization; mitogen-activated protein kinase (MAPK); pro-inflammatory (M1) macrophages; three-dimensional (3D) collagen matrix; transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4).

巨噬細胞是一種高度動態的細胞，參與宿主防御、組織維穩和炎癥消退。解決炎癥和促進組織再生的療法通常以巨噬細胞為靶點，通過各種刺激阻斷促炎（M1）激活通路，并調節其向抗炎（M2）表型分化。

巨噬細胞具有高度的機械敏感性，它們可以感知并響應微環境中的機械刺激。機械刺激，包括拉伸、壓縮和間質流動，會影響巨噬細胞極化，從而驅動促炎和抗炎表型之間的轉換。巨噬細胞中的機械轉導涉及機械傳感器（如粘附分子、細胞骨架成分和離子通道，包括瞬時受體電位香草醛4（TRPV4）通道）的復雜相互作用。

TRPV4 是一種機械敏感離子通道，可由機械刺激、溫度、化學試劑以及內源性或外源性配體激活。TRPV4 激活會誘導構象變化，從而導致 Ca²+ 內流，這在調節巨噬細胞行為和炎癥中至關重要。TRPV4 的藥理學抑制已被證明可以減輕促炎反應。然而，尚未研究 TRPV4 抑制和機械負荷對 3D 環境中巨噬細胞極化的并發影響。

為此，美國托萊多大學生物工程系、生物科學系團隊在最近的一項研究中旨在探索不同機械應變和 TRPV4 抑制劑對 3D 膠原蛋白基質中包埋的促炎巨噬細胞的協同作用。通過在基因和蛋白質水平上評估巨噬細胞表型變化和相關的機械轉導途徑，揭示了 TRPV4 抑制和機械負荷如何調節巨噬細胞的行為，為炎癥消退和組織再生提供潛在的治療見解。研究成果發表于 Frontiers in Immunology 期刊題為“Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation”。首先，為了研究 TRPV4 抑制和/或機械應變（0、3% 和 6%，0.1 Hz）下 TRPV4 表達的變化，用抗-TRPV4 抗體標記 TRPV4 離子通道。抗-TRPV4 抗體染色圖像及其定量表明，在不存在抑制劑的情況下，TRPV4 表達隨著機械應變幅度增加（0%-6%）逐漸增加。然而，在 TRPV4 抑制劑存在的情況下，3% 和 6% 機械應變處理后TRPV4 表達降低，且在 6% 機械負荷組中降低更多。

進一步觀察膠原蛋白內部的結構變化、密度和內部的降解。Masson 三色染色顯示機械應變和TRPV4抑制劑處理后膠原密度的變化（圖1 A），B-CHP 染色可視化和量化膠原蛋白的降解（圖1 B、C）。

圖1 A 顯示，與對照組（TRPV4（0）-0%）相比，暴露于不含 TRPV4 抑制劑的 3% 機械應變的 M1 巨噬細胞（TRPV4（0）-3% ）組表現出松散的膠原纖維結構。在 TRPV4（0）-3% 組中觀察到的低膠原蛋白含量被 TRPV4 抑制劑部分補償。總體而言，與 TRPV4（0）組相比，TRPV4 抑制劑（TRPV4（-）組）處理的 M1 巨噬細胞的膠原纖維更厚。這表明阻斷 M1 巨噬細胞中的 TRPV4 通道可能通過阻止膠原蛋白降解和調節巨噬細胞表型來提高膠原蛋白密度。

圖1 B、C顯示，最高水平的降解發生在沒有 TRPV4 抑制劑的 3% 機械應變組（TRPV4（0）-3%）中，與 Masson 三色染色的觀察結果一致。雖然有或沒有 TRPV4 抑制劑的 0% 機械應變組之間的降解膠原蛋白略有不同，但在 3% 和 6% 機械應變基質中添加 TRPV4 抑制劑導致膠原蛋白變性和降解程度降低（圖1 B）。

圖1 （A）用 Masson 三色染色的膠原纖維（藍色）和細胞核（紫色）的組織學圖像。（B）用 B-CH 染色的 3D 基質中降解的膠原纖維的熒光圖像。（C）圖像分析中降解膠原蛋白的定量。

膠原纖維密度和降解數據的變化表明，在 TRPV4 抑制和機械應變應用后，巨噬細胞存在表型變化。接下來，實驗旨在驗證應用于負載巨噬細胞的 3D 組織基質的 TRPV4 抑制劑和/或機械負荷是否在細胞內水平上產生免疫調節效應。使用 ELISA 評估絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的關鍵成分 ERK1/2 和 p38 MAPKs。正如巨噬細胞機械轉導通路（圖2 A）所示，響應 TRPV4 抑制和機械應變，蛋白激酶C（PKC）被激活，進一步下游傳導到 MAPK、ERK1/2 和 p38 MAPKs，并觸發炎癥反應和促炎細胞因子和趨化因子的表達。

圖2 B 顯示，機械應變和 TRPV4 抑制劑在不同條件下影響 p38 MAPK 表達。在沒有機械應變（0%）的情況下，p38 MAPK 表達在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制組（TRPV4（-））之間沒有顯著變化。在 3% 的機械應變下，p38 MAPK 表達顯著降低至 133.53 pg/ml。在 6% 的機械應變下，TRPV4（0）組 p38 MAPK 表達顯著下調至 138.53 pg/ml，（TRPV4（-））組顯著下調至 149.42 pg/ml。

圖2 C 顯示了每組中與 ERK1/ERK2 蛋白表達相關的吸光度。在沒有機械應變（0%）的情況下，ERK1/2 表達在 TRPV4（0）和 TRPV4 抑制組（TRPV4（-））之間沒有顯著變化。同樣，在 3% 的機械應變下，即使 TRPV4 抑制，ERK1/2 的表達也沒有顯著變化。然而，在 6% 機械應變下，與無機械應變（0%）組相比，TRPV4（0）組的 ERK1/2 表達顯著下調至 0.22AU，TRPV4（-） 組的顯著下調至 0.21AU。

這些數據表明，TRPV4 抑制和機械應變聯合調節巨噬細胞 MAPK 信號通路。

圖2 TRPV4 抑制和機械加載后激活的機械轉導途徑。（B）p38 MAPK 濃度的變化。（C）ERK1/ERK2 合成。

最后，在確認關鍵通路受 TRPV4 抑制和機械負荷調節后，使用基因表達分析研究了 P38 和 ERK1/2 通路調節導致的巨噬細胞表型變化。評估重要促炎標志物（IL-1b、TNF-a、COX2 ）、抗炎標志物（CD163、CCL18）和基質降解標志物（MMP13）的表達（圖3）。

關于炎癥標志物（圖3 A ），數據表明，TRPV4 抑制和機械負荷對IL-1β 表達的影響取決于應變幅度。在無機械負荷下，TRPV4（-）和 TRPV4（0）組之間的 IL-1β 水平沒有顯著變化。當機械應變為 3% 時，TRPV4（0）組的 IL-1β 表達比無應變組增加了近 5 倍，然而，TRPV4（-）組 IL-1β 表達顯著降低。這表明 TRPV4 抑制可以抵消 3% 機械應變時 IL-1β 表達的上調。當機械應變為 6% 時，無論 TRPV4 抑制如何，所有組的 IL-1β 表達均顯著降低。與 TRPV4（0）組的無機械負荷相比，3% 機械應變下 TNF-α 表達顯著增加約 5 倍，然而，TRPV4（-）組在 3% 機械應變下 TNF-α 表達顯著減弱。在 6% 機械應變下，雖然 TRPV4（0）組的 TNF-α 表達與 TRPV4（0）-0% 組相比沒有顯著變化，但在 TRPV4 抑制下，TNF-α表達與 TRPV4（0）-0% 和 TRPV4（0）-6% 組相比均顯著降低。與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）組 3% 和 6% 機械負荷的 COX2 表達分別增加了 2.39 倍和 4.88 倍。TRPV4（-）組 3% 和 6% 的機械負荷的 COX2 表達顯著降低。MMP13 基因表達數據還表明，與 TRPV4（0）-0 組相比，TRPV4（0）組在 3% 應變時MMP13 表達顯著增加。然而，在 TRPV4（-）組 3% 機械應變下，MMP13 表達顯著降低。在 6% 機械應變時，與有和沒有 TRPV4 抑制的 0% 和 3% 機械應變組相比，MMP13 表達在有和沒有 TRPV4 抑制的情況下進一步降低。

關于抗炎標志物，在 TRPV4 抑制后，0% 機械應變組的 CD163 表達沒有顯著變化。在 3% 機械應變時，與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CD163 表達顯著降低。在 6% 機械應變時，與 0% 和 3% 機械應變組相比，TRPV4（0）組的 CD163 表達顯著增加。在 TRPV4 抑制且 6% 機械應變后，CD163 表達與TRPV4（0）組相比降低。在 TRPV4 抑制后，0% 機械應變組的 CCL18 表達也沒有顯著變化。在 3% 機械應變時，與 TRPV4（0）-0% 組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達降低。在 6% 機械應變時，與 0% 和 3% 機械應變組相比，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達增加。然而，在 3% 和 6% 機械負荷組內，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CCL18 表達差異無統計學意義。

熱圖（圖3 B）直觀地顯示了 TRPV4 抑制劑和/或各種機械應變應用后促炎和抗炎基因表達的總體變化。熱圖表明，TRPV4 抑制在 3% 和 6% 的機械應變下顯著降低了促炎基因的表達。具體來說，TRPV4 抑制與 6% 的機械應變協同促進抗炎巨噬細胞表型變化。

圖3 （A）TRPV4 抑制劑和機械應變對 3D 膠原蛋白基質內巨噬細胞促炎和抗炎標志物以及基質降解標志物表達的影響。（B）TRPV4 抑制劑和/或各種機械加載應用后促炎和抗炎基因表達的熱圖。

雖然基因表達數據可能表明在 mRNA 水平上表型向 M1 或 M2 表型轉變，但在沒有蛋白質水平確認的情況下，仍不確定基因水平的變化是否轉化為蛋白質水平并確認巨噬細胞極化。因此，免疫組化用于可視化靶向促炎巨噬細胞標志物 CD80 和抗炎巨噬細胞標志物 CD206 的表面抗體的結合。除了促炎和抗炎表面抗體外，細胞核和絲狀肌動蛋白（F-actin）也分別使用 DAPI 和鬼筆環肽進行標記。將巨噬細胞暴露于有或沒有 TRPV4 抑制劑的各種機械應變幅度下，圖4 顯示了 3D 膠原蛋白基質中巨噬細胞的細胞核、促炎和抗炎標志物以及巨噬細胞 F-肌動蛋白的共聚焦圖像。

抗炎標志物 CD206 在 0% 機械應變和 3% 機械應變組中在 TRPV4 抑制后上調。與沒有 TRPV4 抑制的各自對照相比，TRPV4（-）-0% 和 TRPV4（-）-3% 組中 CD206 表達增加可以明顯證明這一點。相比之下，促炎標志物 CD80 在這些情況下下調，表明向抗炎表型轉變。此外，當 3D 膠原蛋白基質中的巨噬細胞承受 6% 的機械應變時，TRPV4（0）和 TRPV4（-）組的 CD206 表達顯著增加，突出了 6% 機械應變的抗炎作用。

圖4 用 DAPI、F-肌動蛋白和鬼筆環肽、促炎（CD80）和抗炎標志物（CD206）染色的細胞核的共聚焦顯微鏡圖像。

這項研究為 TRPV4 抑制和機械負荷對 3D 膠原蛋白基質中巨噬細胞極化和 ECM 重塑之間的復雜相互作用提供了新的見解。結果表明，機械負荷，尤其是與 TRPV4 抑制結合時，可顯著調節巨噬細胞表型并影響膠原蛋白完整性，從而突出了 TRPV4 在機械轉導和炎癥中的關鍵作用。這些結果對于在炎癥和基質降解是關鍵問題的機械動態組織和疾病中開發靶向抗炎療法具有重要意義。

參考文獻：Babaniamansour P, Jacho D, Rabino A, Garcia-Mata R, Yildirim-Ayan E. Synergetic role of TRPV4 inhibitor and mechanical loading on reducing inflammation. Front Immunol. 2025 Jan 7;15:1456042. doi: 10.3389/fimmu.2024.1456042. PMID: 39850885; PMCID: PMC11756524.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39850885/

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