在生命科學研究中，傳統(tǒng)寬場顯微鏡和共聚焦顯微鏡已得到廣泛應用，但存在光毒性高、成像速度慢等問題。為了解決這些問題，2004 年德國 Stelzer 課題組[1]首次發(fā)明光片熒光顯微鏡（LSFM），它通過薄層光片選擇性照明樣品，創(chuàng)建一個與檢測軸正交的薄激發(fā)光片來照亮樣本的一個平面，從而減少了樣本的光暴露，降低了光漂白和光毒性的風險，同時可實現(xiàn)高速三維成像^[2]，使針對活體的長時間成像成為可能，成為胚胎發(fā)育、神經(jīng)科學和腫瘤等領域研究的重要工具。
 
然而，單一模態(tài)的光片顯微鏡不能適用于多種應用場景，因此其模態(tài)歷經(jīng)了多次變化。從最初的正交雙物鏡和正置 V 形雙物鏡顯微鏡，到八字開頂型雙物鏡顯微鏡，再到如今備受矚目的單物鏡光片顯微鏡，它的每一次進化都在突破應用和成像的極限。今天，我們就來聊聊光片顯微鏡的“變形記”。 
 
最早的光片顯微鏡采用“雙物鏡正交設計”——一個物鏡負責照明（生成光片），另一個垂直放置的物鏡負責成像，如圖a，多用于腦科學和神經(jīng)科學領域。  

為了提升易用性，研究者開發(fā)了正置 V 形雙物鏡顯微鏡，通過傾斜光路適配5 mm 圓形載玻片，如圖b，多用于細胞樣本成像。
 
這種設計雖然簡單，但問題也很明顯：

1.橫向分辨率受限：高數(shù)值孔徑（NA）物鏡的工作距離短，但雙物鏡結構要求照明物鏡有較長工作距離，難以使用油鏡，因此只有低 NA 物鏡，能夠應用于光片成像。（NA≤1.1，對應分辨率約 300 nm）。

2. 無法適配常規(guī)載具：操作空間受限，傳統(tǒng)正交物鏡的樣品必須懸空固定，無法使用常規(guī)載玻片或培養(yǎng)皿。正置 V 形雙物鏡的載具只能是 5 mm 圓形薄玻片，常規(guī)載玻片、培養(yǎng)皿和孔板不能適配。

3. 應用場景單一：無法滿足多尺度、多類型樣本的成像需求。例如，單臺儀器僅能適配特定尺寸或固定形態(tài)的樣本，難以覆蓋從亞細胞到組織水平的多尺度觀測需求。

雖然第一代光片顯微鏡相對于共聚焦顯微鏡光毒性低，成像通量高，但其分辨率及易用性受限，且無法適配常規(guī)載具。
 
為了解決第一代光片顯微鏡無法適配常規(guī)載具，學習和使用成本高的問題，開發(fā)者開發(fā)了八字開頂型雙物鏡--倒置光片顯微鏡，讓樣品放置更符合常規(guī)實驗習慣。

倒置配置是標準樣品載具可用于高分辨率顯微技術的重要先決條件，該配置帶來的弊端主要是成像會產(chǎn)生熒光信號的畸變，因為熒光從樣品中發(fā)射，經(jīng)過水相細胞培養(yǎng)基、傾斜的玻璃蓋玻片和水介質，然后進入檢測物鏡。為了解決熒光信號畸變的問題，開發(fā)者添加了光學元件在兩個倒置物鏡的光路上，但是由于較長工作距離，以及調整畸變的光學元件的增加，使得分辨率受限。
這種設計還存在以下問題：

1.橫向分辨率受限：倒置雙物鏡結構要求照明物鏡有較長工作距離，只能選擇低 NA 物鏡（NA≤1.0，對應分辨率約 330 nm），導致分辨率受限。

2.固定倍率：無法靈活切換物鏡倍率，需專業(yè)的光學工程師手動切換。

3.應用場景受限：無法滿足多尺度、多類型樣本的成像需求。由于物鏡擺放方式犧牲了大部分工作距離（WD），導致實際工作距離很短（如圖所示），因此成像深度低，通常小于 200 µm，厚度較大的樣本無法適用。且平臺維護成本高。
 
為了解決高 NA 物鏡（油鏡）無法使用的問題，研究者們開發(fā)了斜平面顯微鏡（OPM），并提升了光片性能，費鵬教授團隊研發(fā)的高通量貝塞爾斜平面顯微鏡（HBOPM）^[7] ，通過單物鏡斜照明光路設計，將照明與檢測光路整合至同一高 NA 物鏡（NA 1.3 硅油鏡），實現(xiàn)油鏡在光片成像中的應用，進一步突破了光片顯微鏡的分辨率極限，達到亞細胞級分辨率。且為倒置開頂式設計，可以兼容多種常規(guī)載具。

1.無法切換倍率：由于光路中 O1 物鏡和用于傾斜矯正的 O2、O3 物鏡需要精密對齊，僅更換一級探測物鏡不能實現(xiàn)倍率切換，而是需要更換全部物鏡，重建整個光路，因此變倍問題仍需后續(xù)技術優(yōu)化。

2.廣泛使用受限：該成像系統(tǒng)結構復雜，組裝、校準、維護困難，非專業(yè)光學實驗室難以維護。
   
第一代正交雙物鏡光片顯微鏡相對于共聚焦顯微鏡光毒性低，成像通量高，但其分辨率及易用性受限，操作復雜，學習成本高，使用場景單一。

第二代倒置雙物鏡解決了載具兼容性問題，但引入了熒光信號畸變的問題，犧牲了分辨率和實際成像距離（小于 200 μm），并且固定倍率，使用場景受限。

第三代單物鏡進一步突破，解決了高 NA 物鏡（油鏡）無法使用的問題，提升了分辨率，但面臨無法變換物鏡倍率的限制，并且結構復雜，維護困難，導致廣泛使用受限。
 
費鵬教授團隊研發(fā)的 SmartView 顯微系統(tǒng)采用單物鏡光路設計^[3]，超景深共焦探測，實現(xiàn)了片掃共聚焦，兼具共聚焦的操作習慣和光片的成像優(yōu)勢，顛覆了傳統(tǒng)光片顯微鏡的使用局限。一方面，可以具有開放式的樣本操作空間，使其不再需要特制樣本載具，適用于共聚焦培養(yǎng)皿、多孔板、類器官芯片、載玻片等標準載具；另一方面，可以實現(xiàn)物鏡倍率的靈活切換（4 ×-100 ×），可適配油鏡。從亞細胞結構到活細胞，從類器官到全器官，SmartView 能滿足不同應用場景的需求。結合光片顯微鏡光毒性低的特點，可實現(xiàn)對活細胞的精細動態(tài)和相互作用進行快速、三維、長時程地觀測。使得光片顯微鏡的優(yōu)勢能夠最大的發(fā)揮出來。

傳統(tǒng)的光片顯微鏡成像受限于奈奎斯特采樣定律，面臨樣本健康、時間分辨率、空間分辨率以及視場范圍之間的權衡[9]。為了克服這些限制，SmartView 智能光片顯微鏡引入了智能成像方案、基于AI的高效圖像處理算法和大數(shù)據(jù)處理與分析技術進一步提升生物圖像的準確性和信息量。結合先進算法，光片顯微技術可實現(xiàn)更精準的病理切片三維重建和圖像分析，為疾病診斷和治療方案制定提供了更科學的依據(jù)^[10]。
📜 SmartView 核心技術優(yōu)勢解析

🔬 高 NA 單物鏡光片
目前已報道的單物鏡光片顯微鏡的最高實驗驗證數(shù)值孔徑（NA）為1.35[11]，SmartView 顯微系統(tǒng)的數(shù)值孔徑（NA）高達1.5（油浸物鏡），橫向分辨率達 220 nm。

💡 超薄無衍射光片
使用多重調制超薄無衍射照明光片[3]，最薄400 nm，使用這種新型光片可幾乎消除旁瓣干擾，保證高軸向分辨率。

🛠 跨尺度聯(lián)合成像
可自由變倍（4 ×-100 ×），無縫銜接亞細胞結構觀測與全器官三維重建，覆蓋從微觀到宏觀的全尺度研究需求（亞細胞→組織）。

🎯 全流程解決方案
提供從實驗設計、熒光染色到成像分析的全流程解決方案，包括方案優(yōu)化、多色標記指導和高端成像支持，確保高質量數(shù)據(jù)產(chǎn)出，技術團隊全程護航。
 
真正實現(xiàn)了"高分辨+低光毒+全兼容"三位一體：

✓ 高 NA1.5 油鏡
✓ 兼容標準載具
✓ 靈活變倍（4 ×-100 ×）全尺度聯(lián)合成像（亞細胞→組織）
 
參考文獻： 

[1] Huisken J, Swoger J, Del Bene F, et al. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy[J]. Science, 2004, 305(5686): 1007-1009.

[2] 周瑤, 費鵬. 《光片熒光顯微成像技術的發(fā)展及應用》, 激光與光電子學進展, 2024.

[3] Zhao Y, Zhang M, Zhang W, Zhou Y, Chen L, Liu Q, Wang P, Chen R, Duan X, Chen F, Deng H, Wei Y, Fei P, Zhang YH. Isotropic super-resolution light-sheet microscopy of dynamic intracellular structures at subsecond timescales. Nat Methods. 2022 Mar;19(3):359-369. 

[4] Fang C, Yu T, Chu T, Feng W, Zhao F, Wang X, Huang Y, Li Y, Wan P, Mei W, Zhu D, Fei P. Minutes-timescale 3D isotropic imaging of entire organs at subcellular resolution by content-aware compressed-sensing light-sheet microscopy. Nat Commun. 2021 Jan 4;12(1):107.

[5] Wang Z, Zhu L, Zhang H, Li G, Yi C, Li Y, Yang Y, Ding Y, Zhen M, Gao S, Hsiai TK, Fei P. Real-time volumetric reconstruction of biological dynamics with light-field microscopy and deep learning. Nat Methods. 2021 May;18(5):551-556. 

[6] Goda K, Lu H, Fei P, Guck J. Revolutionizing microfluidics with artificial intelligence: a new dawn for lab-on-a-chip technologies. Lab Chip. 2023 Aug 22;23(17):3737-3740. 

[7]Wang Z, Wang J, Zhao Y, Jin J, Si W, Chen L, Zhang M, Zhou Y, Mao S, Zheng C, Zhang Y, Chen L, Fei P. 3D live imaging and phenotyping of CAR-T cell mediated-cytotoxicity using high-throughput Bessel oblique plane microscopy. Nat Commun. 2024 Aug 6;15(1):6677. 

[8] Wang, Z., Wang, J., Zhao, Y. et al. 3D live imaging and phenotyping of CAR-T cell mediated-cytotoxicity using high-throughput Bessel oblique plane microscopy. Nat Commun 15, 6677 (2024). 

[9] 馬異凡，費鵬. 人工智能驅動的光片熒光顯微成像技術（特邀）[J]. 中國激光，2025，52(9): 0907101.

[10] 費鵬, 思文天, 張敏超. 基于光片熒光顯微鏡的三維病理分析綜述（特邀）[J]. 光學學報（網(wǎng)絡版）, 2024, 1(5): 0516002. 

[11]Etai Sapoznik, Bo-Jui Chang, et al. (2020) A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics. eLife 9:e57681.