電轉化儀在電穿孔介導的家畜受精卵基因編輯的應用
電穿孔介導的受精卵基因編輯
如今，將基因編輯物質遞送至牲畜受精卵的普遍方法是顯微注射技術(microinjection ，MI)。這種方法需要昂貴的設備和較高能力要求的技術人員，通過人工一個一個給受精卵注射基因編輯物質，可以對單個受精卵進行特異性的操作，但過程費時費力。且容易導致顯微注射與受精的時間間隔差異較大，同時由于過分依賴操作者，可能會給基因編輯實驗引入不必要的變量。
電穿孔技術提供了一種將基因編輯物質傳遞的新方法�，F今大量實驗中會使用電穿孔技術轉染培養的細胞，同時電穿孔技術也被應用于有效地將基因編輯物質傳遞到小鼠和大鼠的受精卵中。
電穿孔技術需要的設備僅為電穿孔儀和適宜的電極，將受精卵置于電極杯中或載玻片電極上，懸浮在含有基因編輯試劑的培養基中，電穿孔儀通過電極引導電流脈沖通過受精卵，在受精卵的透明帶和質膜上產生暫時性的微孔，從而使基因編輯試劑通過微孔進入受精卵中，進而發揮作用。利用電穿孔的方式可以一次性處理35-100個受精卵，與顯微注射技術相比，電穿孔介導的基因編輯試劑的遞送效率大大增高。
02
哺乳動物受精卵電穿孔條件及優化
由于電穿孔技術操作簡單且效率高，它將成為在家畜物種中實現高通量基因編輯的重要技術支撐。然而，為了獲得高存活率和高效基因編輯受精卵，我們需要對電穿孔參數進行物種特異性的優化，并且有針對性的進行應用。
過往的研究表明，更高的穿孔電壓、更長的脈沖時間和更高的 Cas9/sgRNA 濃度都可以使基因編輯效率提高，但會使受精卵的活力降低。在優化電穿孔條件時，需要在基因編輯效率和受精卵活力之間尋找平衡。不同電穿孔實驗中的最有效參數高度依賴于受精卵的種類、具體基因編輯類型（敲除或敲入）以及靶基因，因此，在不同實驗中有必要優化電轉條件中的相關參數，從而最有效地獲得基因編輯過的動物。
03
應用實例
實例：使用BEX的CUY21EDIT II 電穿孔儀，通過將 CRISPR/Cas9 系統電穿孔到受精卵中，高效生成胰島素( INS )基因突變豬
日本德島大學生物科學與生物工業學院2023 年 1月發表的《Pigs with an INS point mutation derived from zygotes electroporated with CRISPR/Cas9 and ssODN》研究中，開發了一種使用 CRISPR/Cas9 系統通過電穿孔將點突變引入豬受精卵中以生成胰島素基因突變豬，從而為胰島異種移植提供合適的供體。
豬的解剖學特性和生理學特性與人類非常相似，所以轉基因豬有望成為理想異種移植器官的供體。正因如此，為了保護豬胰島免受宿主免疫系統的影響，對胰島微囊化和基因修飾的研究也正在展開開展。豬胰島素與人胰島素的區別在于B鏈羧基末端的一個氨基酸(豬的丙氨酸和人的蘇氨酸)。將豬胰島素(INS)基因給定位置上的一個單核苷酸轉換(引入點突變)，使密碼子54的G變成A (GCC，編碼丙氨酸；ACC，編碼蘇氨酸)，從而可以將豬的胰島素轉化為人的胰島素，使基因工程豬能產生并分泌人胰島素，從而建立胰島異種移植的適宜供體。
在豬中，點突變要么通過基因編輯器和 ssODN 顯微注射到受精卵/胚胎中，要么通過使用基因編輯體細胞的體細胞核移植 (SCNT) 技術引入。然而，目前還沒有關于通過電穿孔產生點突變豬的相關文章。本研究中使用GEEP（gene editing by electroporation of Cas9 protein）方法優化了 HDR 介導的將精確點突變引入豬受精卵INS靶區，并生成了具有INS點突變的豬。
其中，GEEP的電穿孔操作為：將豬受精卵被放置在無核酸酶雙工緩沖液(含有100 ng/μl靶向豬INS基因的gRNA、100 ng/μl Cas9蛋白和16 pmol/μl ssODN)中，置于電極（LF501PT1-20；BEX）間隙中并排成一條線。此后，使用 CUY21EDIT II 電轉儀 (BEX) 對受精卵進行電穿孔（25 V 的五個 1 毫秒脈沖）。電穿孔后，受精卵在PZM-5中培養12小時直至胚胎移植；或在PZM-5中培養3天，然后在豬囊胚培養基中培養4天，以檢測囊胚的基因型以及受精卵的發育能力。
將帶有 1 μM Scr7 的 40-bp 同源的 gRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 電穿孔到受精卵中，使用深度測序分析所得轉基因囊胚的基因型以評估嵌合性，如圖1。13個囊胚中的4個攜帶鑲嵌突變，包括所需的點突變等位基因。13個囊胚中的2個以雙等位基因方式攜帶所需的點突變。
圖 1 對囊胚中的INS靶區進行深度測序分析。gRNA 的目標序列和 PAM 序列分別以藍色和紅色表示。插入和修改的序列分別用綠色和粉色表示。
之后將帶有 1 μM Scr7 的 40-bp 同源的 gRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 電穿孔到受精卵中，然后將它們轉移到兩個受體母豬的輸卵管中。一個受體母豬的每個輸卵管被移植了100個胚胎，兩只母豬都懷孕了，并生下了5只小豬。在耳活檢中對INS基因區域的目標位點進行的深度測序分析表明，所有幼豬都攜帶INS突變，如圖2。
本研究開發了一種通過將 CRISPR/Cas9 系統電穿孔到受精卵中來生成具有所需點突變轉基因豬的新方法，避免了耗時且復雜的顯微操作。通過基因編輯形成的點突變成功地遺傳給了下一代F1，通過將電穿孔介導的點突變引入受精卵成功地建立了用于豬到人異種移植的胰島供體。然而本研究中，引入點突變的效率仍然較低，在未來豬受精卵和胚胎中對HDR 介導的基因修飾的實際操作方法仍需要更多的優化。
04總結
受精卵基因編輯技術現今被用于以多種方式提高相關產業的牲畜生產力和經濟效益。電穿孔可以簡化產生轉基因模式動物與轉基因牲畜的過程，并使缺乏顯微注射技術條件的實驗室將基因編輯試劑快速傳遞到哺乳動物的受精卵中，更便捷地進行受精卵基因編輯。但這一技術仍需要進一步探索和優化，針對不同物種和不同靶基因進行更多的實踐操作，從而在家畜中更高效更快捷地進行非嵌合基因敲除和靶向基因插入。
產品介紹
日本BEX公司新CUY21EDITII電轉化儀可滿足活體、受精卵、貼壁細胞、懸浮細胞以及難轉染細胞的高效基因導入。由成立于1990年的活體轉基因技術及細胞融合技術全球領導者——BEX公司推出。采用先進的脈沖技術，支持恒流輸出、動態衰減脈沖和反轉脈沖模式，是一款無需專用試劑的全功能多模式活體細胞轉染儀器，目前已廣泛應用于全球實驗室。
CUY21EDITIl可應用于細胞和組織的高效轉染，尤其適合于原代細胞、免疫細胞、干細胞等難轉染細胞的高轉化率和高存活率轉化。同時，CUY21EDITIl還可應用于貼壁細胞、離體受精卵及活體的基因轉染，根據不同實驗需求選擇相應電極進行體內體外的轉染。
參考文獻：
[1] Tanihara, F., Hirata, M., Namula, Z., Do, L. T. K., Yoshimura, N., Lin, Q., Takebayashi, K., Sakuma, T., Yamamoto, T., & Otoi, T. (2023). Pigs with an INS point mutation derived from zygotes electroporated with CRISPR/Cas9 and ssODN. Frontiers in cell and developmental biology, 11, 884340. https://doi.org/10.3389/fcell.2023.884340
[2] Raza SHA, Hassanin AA, Pant SD, Bing S, Sitohy MZ, Abdelnour SA, Alotaibi MA, Al-Hazani TM, Abd El-Aziz AH, Cheng G, Zan L. Potentials, prospects and applications of genome editing technologies in livestock production. Saudi J Biol Sci. 2022 Apr;29(4):1928-1935. doi: 10.1016/j.sjbs.2021.11.037. Epub 2021 Nov 24. PMID: 35531207; PMCID: PMC9072931.
[3] Lin, J. C., & Van Eenennaam, A. L. (2021). Electroporation-Mediated Genome Editing of Li
