在體鈣成像實驗手術流程

簡介
鈣成像技術（calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監測組織內鈣離子濃度的方法。在神經系統研究方面，鈣成像技術廣泛應用于檢測神經元的活動情況。有了鈣成像技術，原本悄無聲息的神經活動就變成了一幅斑斕閃爍的壯觀影像，科學家終于可以親眼看著神經信號在神經網絡之中往來穿梭。鈣成像技術在神經科學、生理與藥理研究、疾病模型研究和新藥篩選與開發等領域具有廣闊的應用前景，能夠幫助科學家深入了解細胞內的生理和病理過程。
 
原理
在哺乳動物的神經系統中，鈣信號與神經細胞的興奮性、細胞通訊、遞質釋放、突觸可塑性以及基因轉錄等諸多生理、病理過程相關。
當神經元膜電位發生去極化，產生的動作電位傳導到神經元軸突末梢時，細胞膜上的電壓門控鈣離子通道打開，大量鈣離子內流，包含神經遞質的囊泡由突觸前膜釋放至后膜，下游神經元就得以接受到上游的信號。鈣離子濃度可以表征突觸傳遞和神經元活動。神經元鈣成像技術的原理就是借助鈣離子濃度與神經元活動之間的嚴格對應關系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質熒光探針（鈣離子指示劑，calcium indicator），將神經元中的鈣離子濃度通過熒光強度表現出來，從而達到監測神經元活動的目的。
 
鈣成像技術應用
1. 記錄培養的神經元的活動；
2. 記錄腦片上神經元的活動；
3. 活體記錄神經元的活動。由于離體實驗本身的限制，現在越來越多的神經科學家傾向于做活體鈣成像實驗，希望能得到更準確且更能反應生理狀況的數據。得益于在體熒光顯微鏡的發展，現在，在實驗動物處于活體狀態下進行鈣成像記錄的技術取得了飛速進展。
4. 活體記錄神經元樹突和樹突棘（spine）的活動。由于對實驗精度的要求，有些科學家不僅僅想記錄單個神經元的反應，他們還想更精確地知道神經元上哪些樹突和樹突棘參與了某個行為，也就是說他們需要在活體條件下，對單根樹突以及樹突上spine進行鈣成像記錄實驗。由于雙光子熒光顯微鏡和GCaMP6基因編碼鈣離子指示劑的發展，現在，對樹突和樹突棘用鈣成像實驗進行記錄也成為了可能。
 
實驗準備

• 實驗對象

（1）GCaMP或WT小鼠
（2）大鼠
 

• 設備

（1）腦立體定位儀
（2）Inscopix在體自由活動神經元成像系統
（3）異氟烷麻醉系統
（4）體溫維持儀和恒溫墊
（5）手術工具，包括眼科剪、精細鑷、胰島素注射器
（6）顱鉆、0.5mm（或0.6mm、0.8mm、1.0mm）鉆頭
 

• 材料和試劑

（1）Inscopix Lens
（2）鏡頭濕巾
（3）棉簽
（4）Metabond骨膠
（5）Kwik-Sil生物硅膠
（6）紅霉素眼膏
（7）生理鹽水
（8）酒精
（9）碘伏
（10）冰
（11）鎮痛藥
 
 
實驗步驟

1. 優化病毒
首先通過組織學檢查評估特定病毒 GCaMP 指示劑（此過程可能需要多次稀釋）的優化效果。
2. 注射病毒
注射病毒到感興趣的腦區在特定的細胞上表達GCaMP。
 
3. 埋置透鏡 :
埋植到表達了 GCaMP6 的細胞區域，用來連接微型顯微鏡。
1）將動物固定到立體定位儀上，準備顱骨進行手術（清除組織/血液并平整顱骨）。
 
（1）動物預麻醉后，通過耳桿和上齒固定辦固定于立體定位儀上
（2）減去頭部的毛
（3）將紅霉素眼膏涂抹到小鼠眼睛上
（4）使用碘伏和75%酒精進行頭部皮膚的消毒
（5）沿矢狀縫作切口，剝離筋膜及肌肉，推開骨膜，用干棉球擦拭，暴露骨縫，止血。
（6）使用手術刀或顱鉆對顱骨進行粗糙處理。
（7）通過前囟和后囟，以及前囟旁開位置（如圖中±2.0mm）進行顱骨調平。前囟和后囟的DV＜50um。前囟旁開位置的DV＜50um。
 
2）在立體定位儀上準備定位針并調整頭骨
（1）準備ProView植入套件，30G鈍針，V形夾
（2）組裝ProView植入套件，并將30G鈍針夾持到底座支架上
（3）將ProView植入套件固定到立體定位儀上
（4）將30G鈍針定位到前囟點
（5）定位成像位置
 
3）GRIN Lens植入
（1）使用顱鉆在成像位置進行開顱
（2）通過ProView植入套件將Lens植入到目標區域位置。
備注：植入Lens的方法取決于Lens的規格和大腦區域。

4. 連接并成像
對神經元進行成像并記錄數周甚至幾個月的數據。當神經元細胞激活后，胞內鈣（Ca²⁺）水平增加，GCaMP 與鈣離子結合并產生瞬時熒光信號。
 
5. 處理數據
 
將鈣離子信號通過數據采集主機（DAQ）傳輸到電腦上。使用 Inscopix Data Processing 數據處理軟件處理鈣成像視頻，提取細胞、波形和事件。
 
附件：

不同腦區適用Lens規格參考表