超連續(xù)譜光源在激光層照顯微鏡Lightsheet使用中的優(yōu)勢及應用

瀏覽次數(shù)：5321　發(fā)布日期：2020-12-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

在路易斯安那州新奧爾良的神經(jīng)科學年度會議上，卡爾蔡司的顯微鏡事業(yè)部提出了一項新的顯微技術(shù)，即激光層照顯微鏡(Lightsheet )。這給生物學家?guī)砹嗽诨铙w生物動態(tài)成像研究上的新方法。

▲Lightsheet觀察的小鼠大腦

生命觀察

生物學家可以使用新的顯微系統(tǒng)觀察整個生物體在幾天甚至更長時間內(nèi)的發(fā)育。極低的光毒性和整合的培養(yǎng)系統(tǒng)可以在不損傷樣本的情況下觀察細胞群的分化。在大型生物活體上，特別是像果蠅或斑馬魚胚胎，相比已有的熒光顯微鏡觀察方式來說，激光層照顯微鏡(Lightsheet)可以提供更多的信息。

同時，激光層照顯微鏡也可被用于海洋，細胞生物學和植物生理學。它的光照光束(層照光束)只會照亮樣本很薄的一層，因而起到保護樣本其他部分的作用。并且它的成像光束與光照層成90度角。因此，激光層照顯微鏡能在最小的照明強度下獲得的圖像質(zhì)量，尤其適合于活體樣本的長期試驗。成像從不同的觀察角度獲得數(shù)據(jù)，再通過數(shù)學運算進行三維重建和時間序列視頻錄制。

Lightsheet 激光層照系統(tǒng)使用了可實現(xiàn)柱面透鏡光學與激光掃描相結(jié)合的新型光學概念。用戶能從復雜的實驗樣本上得到均勻的光學切片信息。

▲Lightsheet觀察的小鼠海馬區(qū)

開創(chuàng)熒光顯微技術(shù)新紀元

Lightsheet 是觀察活體樣品發(fā)育的一種對樣品損傷低的方法，它開啟了研究新紀元。以下為激光片層掃描顯微技術(shù)（Light Sheet Fluorescence Microscopy）的應用：

一、形態(tài)發(fā)育和胚胎形成

在斑馬魚和黑腹果蠅等模式生物胚胎形成階段，對細胞進行時間、空間模式的熒光成像。

二、器官發(fā)育與細胞動力學

胚胎與小型生物中細胞動態(tài)過程的快速成像，例如：細胞遷移、心臟發(fā)育、血流、血管發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育及鈣成像。

三、三維細胞培養(yǎng)

三維細胞培養(yǎng)、球體和囊腫、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)的實時成像。如細胞遷移、表達模式及細胞增殖的分析。

四、對光透樣品成像

對熒光標記的固定樣品（組織切片、小鼠大腦、胚胎、器官、球狀體和活組織切片）成像，采用折射率 n=1.38 或 n= 1.45 的水性透明介質(zhì)對樣品進行光透處理。選用 Scale A2，n=1.38，（Hama 等，Nat Neurosci 期刊，2011 年）或 FocusClear™ （CelExplorer Labs 公司，http://www.celexplorer.com）澄清液，n=1.45（Chung 等，Nature 期刊，2013 年）處理。

五、植物

觀察敏感的發(fā)育過程和執(zhí)行生理測量。

六、海洋生物成像

使用 Lightsheet對海洋生物進行熒光成像，例如：海鞘、魷魚、浮游生物及扁形蟲。

七、熒光標記的活體樣品的結(jié)構(gòu)特性

固定和活體樣品的精細三維結(jié)構(gòu)成像，例如：斑馬魚和青鳉魚。

激光器

目前Lightsheet顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)，常用的激光器包括以下四種類型:

半導體激光器:405nm(近紫外譜線)

氬離子激光器:457nm、477nm、488nm、514nm(藍綠光)

氦氖激光器:543nm(綠光-氦氖綠激光器)633nm (紅光-氦氖紅激光器)

UV激光器(紫外激光器):351 nm、364 nm(紫外光)

為了適應多種觀測需求一般采用多激光系統(tǒng)，需要用到多個獨立的激光器經(jīng)過復雜的系統(tǒng)耦合到一起，系統(tǒng)復雜且成本高昂。現(xiàn)在NKT公司推出的超連續(xù)譜光源完美的解決了這個問題。

超連續(xù)譜光源的優(yōu)勢

超連續(xù)譜是指高功率的窄脈沖的入射光通過非線性介質(zhì)時，由于自相位調(diào)制（SPM），交叉相位調(diào)制（XPM），受激拉曼散射（SRS）,和四波混頻（FWM）等非線性效應與光纖群速度色散（GVD）的共同作用，出射光譜中產(chǎn)生許多新的頻率成分，光譜寬度遠遠大于入射光脈沖的譜寬，頻譜范圍從可見光一直連續(xù)擴展到紫外和紅外區(qū)域。