圖. 譜系追蹤策略^[1]

自1990年代初以來，基因修飾技術(shù)一直用于細(xì)胞譜系追蹤，目前已經(jīng)成為了大多數(shù)譜系示蹤研究的首選方法。目前，體內(nèi)的遺傳細(xì)胞追蹤技術(shù)主要分為兩種類型，一種是基于KI/TG策略，直接將報(bào)告基因與目的基因連接，以達(dá)到標(biāo)記目的細(xì)胞的效果；另一種是基于 Cre-loxP 、Dre-rox 、FLP-FRT等基因位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，利用細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的重組酶，特異性地激活報(bào)告基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞及所有后代的永久遺傳標(biāo)記。
 

基于KI/TG策略的細(xì)胞標(biāo)記

使用轉(zhuǎn)基因（Tg）或基因敲入（KI）的方式，將報(bào)告基因整合進(jìn)目的基因（常為目的細(xì)胞marker或細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動子），即可實(shí)現(xiàn)針對特定細(xì)胞的標(biāo)記。

這種細(xì)胞標(biāo)記的構(gòu)建分為以下幾種類型：
01
隨機(jī)轉(zhuǎn)基因
將含有報(bào)告基因的外源DNA片段克隆至PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中，與轉(zhuǎn)座酶一起注射到小鼠受精卵中。在轉(zhuǎn)座酶作用下，外源DNA片段將會被整合到基因組上的TTAA位點(diǎn)處，從而獲得表達(dá)報(bào)告基因的小鼠。

02
基因敲入——融合表達(dá)

將報(bào)告基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的5'端或3'端，與內(nèi)源基因融合表達(dá)。

03
基因敲入——共表達(dá)
將報(bào)告基因通過2A（自剪切多肽）或IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列）元件敲入到小鼠內(nèi)源基因的3'端。

04
基因敲入——取代表達(dá)
將報(bào)告基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的5'端，并取代小鼠本身的基因，使敲除和敲入同時(shí)發(fā)生。
 

通過KI/TG策略標(biāo)記的細(xì)胞，僅可標(biāo)記目前正在表達(dá)目的基因的細(xì)胞。曾經(jīng)表達(dá)目的基因但現(xiàn)在不表達(dá)的細(xì)胞，與現(xiàn)在正在表達(dá)，但分化后不表達(dá)目的基因的后代細(xì)胞均不會被報(bào)告基因標(biāo)記。因此，基于KI/TG策略的細(xì)胞標(biāo)記適用于基因表達(dá)監(jiān)測、細(xì)胞定位等無需關(guān)注目的細(xì)胞后代的研究。

基于基因重組酶系統(tǒng)策略的細(xì)胞標(biāo)記

基因位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)一般指通過特異位點(diǎn)重組酶 (site-specific recombinases, SSRs) 介導(dǎo)重組酶特異識別位點(diǎn) (recombination target sites, RTs) 間的重組，來實(shí)現(xiàn)特異位點(diǎn)的基因敲除、基因插入、基因翻轉(zhuǎn)和基因易位等操作。

基于基因位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于器官發(fā)育、組織再生和疾病研究。目前，多種重組酶系統(tǒng)被普遍使用，例如Cre-loxP、Flp-frt和Dre-rox系統(tǒng)。其中使用最普遍的為Cre-loxP系統(tǒng)。

01
Cre-loxP系統(tǒng)
借助重組酶系統(tǒng)構(gòu)建條件性表達(dá)報(bào)告基因的小鼠模型需要使用到至少兩種類型的小鼠。以Cre/loxP系統(tǒng)為例，首先將攜帶報(bào)告基因的DNA序列插入到小鼠的Rosa26位點(diǎn)上，并在啟動子和報(bào)告基因之間插入轉(zhuǎn)錄終止盒（loxp-stop-loxp）構(gòu)建Flox鼠；同時(shí)構(gòu)建特異性Cre鼠（由特定啟動子驅(qū)動或連接在特定細(xì)胞marker之后，可在特定細(xì)胞或組織表達(dá)Cre重組酶）。將上述兩種小鼠交配后，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，該小鼠在表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞或組織中，終止盒被Cre重組酶切除，因此僅在這些細(xì)胞或組織中才會表達(dá)報(bào)告基因。
 

02
CreERT2-loxP系統(tǒng)
為實(shí)現(xiàn)重組的時(shí)間與空間的雙重控制，又進(jìn)一步開發(fā)了CreERT2-loxP系統(tǒng)，可使用他莫昔芬進(jìn)行誘導(dǎo)重組，從時(shí)間上調(diào)控Cre-loxp重組。這種方法也被稱為誘導(dǎo)型Cre重組酶系統(tǒng)。
雌激素受體（estrogen receptor，ER）是雌酮、雌二醇等女性荷爾蒙的細(xì)胞內(nèi)蛋白受體。在沒有雌激素的情況下，雌激素受體跟胞質(zhì)中的熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）結(jié)合在一起。由于熱休克蛋白的阻擋，雌激素受體無法進(jìn)入細(xì)胞核，只能游蕩于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。雌激素出現(xiàn)后，雌激素受體會與雌激素結(jié)合，并與HSP90解離，后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因表達(dá)。
CreERT2就是將雌激素受體的配體結(jié)合域和Cre酶共表達(dá)，借助ERT2的特性，通過他莫昔芬調(diào)控基因重組。
 

基于CreERT2系統(tǒng)的細(xì)胞標(biāo)記依賴于他莫昔芬誘導(dǎo)。當(dāng)他莫昔芬存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄終止盒（stop序列）被去除，細(xì)胞開始表達(dá)報(bào)告基因；當(dāng)他莫昔芬代謝完后，基因重組不會再進(jìn)行。因而，CreERT2策略標(biāo)記的細(xì)胞來源于他莫昔芬代謝期中表達(dá)Marker基因（表達(dá)CreERT2）的細(xì)胞與這些細(xì)胞的后代。在他莫昔芬代謝結(jié)束后，即使表達(dá)Marker基因（表達(dá)CreERT2）的細(xì)胞也不會被報(bào)告基因標(biāo)記。

總結(jié)：

除了上述外，根據(jù)重組類型和數(shù)量，基因重組系統(tǒng)可以分為傳統(tǒng)的單重組酶介導(dǎo)的遺傳方法與更復(fù)雜的單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)方法和多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法，下一期鼠博士為大家講解單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)。

Reference：
[1] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020;295(19):6413-6424. doi:10.1074/jbc.REV120.011631

關(guān)于我們
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產(chǎn)品解決方案。