固有免疫系統是機體抵御病原體入侵的第一道防線，在抗病毒免疫中發揮著重要作用。RNA病毒因其高變異性，常常引發致命的大流行病，對人類健康構成重大威脅。固有免疫系統通過識別病原體的特異性分子模式，迅速啟動免疫反應，從而阻止病毒的進一步擴散。RIG-I（Retinoic Acid-Inducible Gene I）作為一種重要的胞質RNA感受器，在識別病毒雙鏈RNA（dsRNA）后，能夠觸發抗病毒免疫應答。然而，RIG-I的激活機制及其動態調控過程仍存在許多未解之謎。近日，由浙江大學張龍教授領導的研究團隊發現，RIG-I分子間C864-C869二硫鍵的形成對于其相分離及其介導的抗病毒免疫應答至關重要。此外，研究還開發了靶向穩定或抑制RIG-I二硫鍵形成的干預策略，為抗病毒治療及自身免疫性疾病的治療提供了新的思路。這項研究成果于2025年4月發表在國際知名期刊《Nature Cell Biology》。
 

研究材料與方法
為了深入探究C864-C869分子間二硫鍵的形成在RIG-I介導的固有免疫應答中的作用，本研究使用RIG-I分子間二硫鍵形成缺陷型基因敲入小鼠模型（Rig-I^C865S/C865S）進行了小鼠水平的驗證。該敲入小鼠模型由賽業生物公司通過CRISPR-Cas9 技術構建。為了生成敲入后代，將針對小鼠Rig-I基因的gRNA、含有p.C865S（TGC至AGC）突變和一個同義突變p.S871=（AGC至TCT）的供體寡核苷酸以及Cas9 共同注射到受精卵中。

技術路線

質譜分析發現病毒刺激引起RIG-I分子間C864-C869二硫鍵的形成
↓
通過基因編輯技術構建Knock-in小鼠，驗證C864-C869二硫鍵的功能
↓
使用遺傳密碼拓展技術，在RIG-I C864位點引入非天然氨基酸，實現分子間二硫鍵的穩定交聯
↓
開發靶向抑制RIG-I二硫鍵形成的干擾肽

研究結果
（1） RIG-I二硫鍵的鑒定與驗證
研究團隊發現病毒刺激能夠誘導RIG-I分子間二硫鍵的形成。為了確定RIG-I分子間二硫鍵形成的位點，研究人員對有無SeV病毒刺激情況下的RIG-I進行了質譜分析。質譜結果顯示，在SeV病毒刺激下，RIG-I蛋白分子間能夠形成C864-C869 位點的二硫鍵；而在沒有病毒刺激時，未檢測到分子間二硫鍵的形成。
 

圖1. RNA病毒刺激誘導RIG-I蛋白間形成C864-C869位點的分子間二硫鍵

（2）C864-C869分子間二硫鍵的形成對于RIG-I介導的固有免疫應答至關重要
研究團隊使用賽業生物公司提供的RIG-I分子間二硫鍵形成缺陷型基因敲入小鼠模型進行了小鼠水平的驗證。探究結果發現：C865S點突變（對應人C864S突變）導致RIG-I寡聚化和凝聚體形成缺陷，顯著抑制固有免疫反應，使小鼠對VSV病毒感染的易感性增加并伴隨死亡率上升。
 

圖2. C864-C869分子間二硫鍵的形成對于RIG-I介導的固有免疫應答至關重要

（3）靶向RIG-I C864-C869分子間二硫鍵以調控宿主抗病毒免疫應答
研究人員開發了靶向穩定或抑制RIG-I C864-C869二硫鍵形成的干預策略。通過遺傳密碼拓展技術，在RIG-I C864位點引入非天然氨基酸，實現了分子間二硫鍵的穩定交聯。實驗結果表明，靶向穩定RIG-I二硫鍵的形成可以顯著增強宿主抗病毒免疫應答能力。同時，研究團隊通過體內外實驗證明，疾病相關的RIG-I病理突變（如C268F或E373A）或mtRNA泄漏至胞質中均能導致RIG-I異常激活，從而引發異常的固有免疫應答。RIG-I的病理突變或mtRNA引起的異常激活依賴于C864-C869位點的分子間二硫鍵形成。為此，該研究開發了靶向抑制RIG-I C864-C869分子間二硫鍵形成的干擾肽RIP-III。在相關細胞和小鼠模型中，RIP-III能夠有效抑制這些異常的RIG-I介導的免疫應答。

圖3. 靶向RIG-I C864-C869分子間二硫鍵以調控宿主抗病毒免疫應答

總結
該項研究首次揭示了RIG-I在響應RNA病毒感染時發生分子間二硫鍵這一過程。研究發現，RIG-I分子間C864-C869二硫鍵的形成對于其相分離及其介導的抗病毒免疫應答至關重要。此外，研究團隊開發了靶向穩定或抑制RIG-I二硫鍵形成的干預策略，為抗病毒治療及自身免疫性疾病的治療提供了新的思路。該項研究不僅為RIG-I的激活機制提供了更為深入的見解，還為開發針對RIG-I介導的相關疾病的臨床治療藥物奠定了堅實的基礎。研究中使用的賽業OriCell®提供的動物模型，為實驗的順利進行提供了重要支持。未來，基于RIG-I二硫鍵調控的抗病毒策略有望在臨床中得到廣泛應用，為人類健康保駕護航。