上一期我們給大家介紹了Cre-lox系統(tǒng)的基本原理，不知道大家有沒(méi)有理解呢？點(diǎn)擊查看：小鼠大學(xué)問(wèn) | Cre-Lox系統(tǒng)核心原理全解析

本期我們給大家?guī)��?lái)了Cre-lox系統(tǒng)的一些常見(jiàn)問(wèn)題。幫助大家更好的利用Cre-lox系統(tǒng)進(jìn)行研究。

Cre小鼠的建立方法對(duì)Cre表達(dá)的影響

早期構(gòu)建Cre小鼠主要采用隨機(jī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。具體而言，是將帶有外源特異性啟動(dòng)子的Cre基因序列隨機(jī)整合到小鼠基因組的某個(gè)位置。然而，采用這種方法得到的轉(zhuǎn)基因小鼠，其整合位點(diǎn)和基因拷貝數(shù)均不可控。由于整合位置的隨機(jī)性，Cre重組酶的表達(dá)可能會(huì)受到染色體狀態(tài)的干擾，例如，DNA甲基化等表觀遺傳修飾可能會(huì)導(dǎo)致Cre基因的沉默，進(jìn)而影響Cre重組酶的正常表達(dá)。

因此，更為可靠的方法是通過(guò)基因打靶（ES細(xì)胞或CRISPR/Cas9途徑）的方式將單拷貝的Cre基因定點(diǎn)整合到內(nèi)源基因座中。主要有以下兩種：
（1）取代型表達(dá)Cre表達(dá)框直接插入到內(nèi)源基因起始密碼子前；
（2）共表達(dá)型的構(gòu)建方式是將Cre表達(dá)框通過(guò)2A（自剪切多肽）或IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列）元件敲入到小鼠內(nèi)源基因的3'端。
 

圖1. 取代型表達(dá)

圖2. 共表達(dá)

如何測(cè)試一個(gè)新的Cre小鼠品系

通常我們會(huì)利用Reporter小鼠與Cre小鼠雜交來(lái)驗(yàn)證Cre的表達(dá)譜。Reporter小鼠一般是在Rosa26位點(diǎn)插入了帶有l(wèi)ox-stop-lox終止盒以及緊隨其后的報(bào)告基因。在沒(méi)有Cre酶存在的情況下，報(bào)告基因不會(huì)表達(dá)。當(dāng)與Cre小鼠雜交后，Cre酶會(huì)識(shí)別并切除lox-stop-lox終止盒，使報(bào)告基因得以表達(dá)，通過(guò)觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況，可推斷出Cre酶的活性及其作用范圍。

圖3. 共表達(dá)^[1]

Cre重組酶的意外表達(dá)

通常，我們希望Cre重組酶僅在特定組織/細(xì)胞中發(fā)揮作用，但其意外表達(dá)（即“異位”表達(dá)）仍然可能發(fā)生，這可能導(dǎo)致非預(yù)期的重組事件發(fā)生。因此，在構(gòu)建Cre小鼠模型時(shí)，選擇高特異性的Marker基因至關(guān)重要。這些基因可以高效、精確地驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)，從而降低漏表達(dá)或異位表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)盡量避免使用高表達(dá)但非特異的Marker基因，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

在使用Reporter小鼠驗(yàn)證組織特異性Cre小鼠時(shí)，常常會(huì)發(fā)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)比預(yù)期的更為廣泛。為確認(rèn)是否發(fā)生了生殖系中的Cre意外表達(dá)，可通過(guò)將不同性別的子代小鼠（Cre/+; flox/+）分別與野生型小鼠交配，以獲得第二代子代。如果第二代小鼠的報(bào)告基因表達(dá)范圍顯著擴(kuò)大，這表明很有可能發(fā)生了Cre的生殖系表達(dá)。因?yàn)镃re介導(dǎo)的重組可能發(fā)生在配子形成的二倍體階段，從而導(dǎo)致后代即使未攜帶Cre，仍表現(xiàn)出報(bào)告基因的表達(dá)。

若Cre小鼠發(fā)生生殖系表達(dá)，使用該Cre小鼠進(jìn)行條件性基因打靶時(shí)，需謹(jǐn)慎選擇性別和交配方式。例如，母系遺傳的Cre小鼠品系應(yīng)使用雄性Cre陽(yáng)性小鼠進(jìn)行繁育，而父系遺傳的Cre小鼠品系則需使用雌性Cre陽(yáng)性小鼠進(jìn)行繁育。此外，誘導(dǎo)型Cre小鼠是一種有效的解決方案，通過(guò)僅在成年期或胚胎發(fā)育晚期激活Cre重組活性，可避免生殖系的意外表達(dá)，從而獲得更可靠的條件性基因打靶模型。
 

條件性敲除小鼠的繁育策略

cKO小鼠通常需要把兩個(gè)等位基因全部刪除，才能達(dá)到基因敲除的目的，故其flox等位基因的基因型應(yīng)該為純合。一般情況下，Cre工具鼠一般是半合子/雜合子。（保證cre基因的拷貝數(shù)一致，避免重組效率不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差；Cre小鼠的構(gòu)建方式為轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入或取代型敲入時(shí)，可能會(huì)破壞內(nèi)源基因的表達(dá)，使用半合子/雜合子在一定程度上可以避免該影響。）由此可見(jiàn)，cKO小鼠的目標(biāo)基因型一般是cre/+；flox/flox。（此處+代表wildtype）
 

圖4. 條件性敲除小鼠的繁育策略
 

首先，將Cre雜合子小鼠與flox雜合子或純合子小鼠交配，獲得的Cre與flox雙陽(yáng)性（Cre/+; flox/+）子代小鼠。之后，再將Cre與flox雙陽(yáng)性（Cre/+; flox/+）子代小鼠與flox雜合子或純合子小鼠交配，獲得所需的cre/+；flox/flox小鼠為實(shí)驗(yàn)組。一般對(duì)照組為同窩+/+；flox/flox小鼠。

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References
[1]. Duffield JS, Humphreys BD. Origin of new cells in the adult kidney: results from genetic labeling techniques. Kidney Int. 2011 Mar;79(5):494-501. doi: 10.1038/ki.2010.338. Epub 2010 Sep 22. PMID: 20861816.

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