眼-腦軸新突破：眼部3D成像應用于阿爾茨海默病Aβ檢測
近年來，隨著對AD病理機制的深入研究，科學家們發現眼睛作為中樞神經系統的延伸，可能成為檢測腦部AD病理變化的無創窗口。光片熒光顯微鏡（LSFM）結合組織透明化技術的出現，為研究眼與腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）的三維分布提供了有力工具。
研究背景與技術挑戰
AD早期診斷的困境與眼部檢測的潛力
隨著對AD病理機制的深入研究，科學家們發現眼組織與腦組織在胚胎起源及結構功能上有密切聯系，這使得眼睛有望成為檢測腦部AD病理變化的無創窗口。眼部的視網膜、視神經等結構不僅在解剖上與大腦相連，而且在生理和病理過程中也具有相似性。然而，盡管眼部檢測具有無創、便捷、成本低等優勢，但如何準確量化眼部Aβ并建立其與腦部Aβ負擔的相關性仍是一個亟待解決的問題。
二維成像技術在評估完整眼球中Aβ的三維空間分布方面存在明顯局限。二維切片方法破壞了眼球的三維結構完整性，難以全面捕捉Aβ在整個眼球中的分布特征。此外，二維圖像的分析往往依賴于對有限切片的觀察和測量，容易導致數據的片面性和不準確性。
組織透明化與三維成像的技術難題
光片熒光顯微鏡（LSFM）結合組織透明化技術為解決上述問題提供了新的可能性，但在實際應用中也面臨諸多技術難題。首先，如何優化透明化方案，確保眼球各部分組織的均勻透明化，同時避免組織結構的破壞和抗原性的喪失，是該技術面臨的一個關鍵挑戰。其次，三維成像需要高分辨率的顯微鏡系統和精確的圖像重建算法。在對完整眼球和大腦進行成像時，如何在大樣本范圍內實現均勻的熒光激發和信號檢測，以及如何處理和分析海量的三維圖像數據，也是需要克服的技術障礙。此外，為了實現對Aβ的特異性標記，還需要選擇合適的熒光探針或染色劑，并優化染色條件，以減少背景信號和非特異性結合，提高成像的靈敏度和特異性。
技術創新與應用
光片熒光顯微鏡結合組織透明化技術的原理與優勢
光片熒光顯微鏡（LSFM）結合組織透明化技術是本研究的核心創新點之一。組織透明化技術通過化學方法去除樣本中的脂質和部分蛋白質，使原本不透明的生物組織變得透明，從而允許光線深入穿透樣本，為三維成像提供了基礎。LSFM則利用薄薄的光片對樣本進行逐層激發，僅照亮焦平面處的熒光分子，減少了非焦平面的熒光干擾，提高了成像的信噪比和分辨率。與傳統的共聚焦顯微鏡相比，LSFM具有成像速度快、光漂白和光毒性低等優勢，特別適合對大體積樣本進行高分辨率三維成像。結合組織透明化技術，LSFM可以實現對完整眼球和大腦組織中Aβ的深度可視化，揭示其在三維空間中的分布特征和相互作用關系，為研究阿爾茨海默病的病理機制提供了前所未有的視角。
多重標記與成像方案的設計
為了全面評估阿爾茨海默病小鼠眼與腦中的Aβ負擔以及相關的神經炎癥反應，研究團隊設計了一種多重標記與成像方案。具體來說，使用硫黃素S對Aβ進行特異性染色，這是一種常用的Aβ染色劑，能夠與Aβ斑塊中的β-疊結構特異性結合，發出熒光信號。同時，采用抗CD11b抗體標記小膠質細胞和抗ACSA-2抗體標記星形膠質細胞，以觀察神經炎癥細胞在Aβ沉積周圍的反應情況。這種多重標記方案使得研究人員能夠在同一張三維圖像中同時觀察到Aβ斑塊、小膠質細胞和星形膠質細胞的分布和相互關系，為深入理解阿爾茨海默病的病理生理過程提供了豐富的信息。在成像參數設置方面，研究人員根據不同的熒光標記物選擇了相應的激發波長（488nm、561nm和647nm），并優化了顯微鏡的光片厚度、步長和曝光時間等參數，以確保獲得高質量的三維圖像。
在數據分析方面，研究團隊采用了Imaris軟件生成感興趣區域的三維表面模型，并結合自動閾值算法實現了對Aβ顆粒的準確分割和量化。自動閾值算法通過分析圖像的灰度直方圖，自動確定最佳閾值以區分目標信號和背景噪聲，減少了人為因素對結果的影響。同時，為了進一步提高分割的準確性，研究人員還進行了手動修正，去除非細胞顆粒的誤識別，如纖維狀塵埃等。通過這種半自動化的分析流程，研究人員能夠精確測量每個Aβ顆粒的體積、表面積等參數，并對整個眼球和大腦中的Aβ負擔進行量化分析。此外，研究團隊還開發了一種基于體積渲染的可視化方法，將復雜的三維數據轉化為直觀的圖像，便于觀察和比較不同樣本之間的差異。這種方法不僅提高了數據分析的效率和準確性，還為研究結果的展示和解釋提供了有力支持。
成像實驗與結果分析
AD小鼠與對照組樣本的收集與處理
研究人員選取了10只44周齡的5xFAD轉基因AD小鼠和7只同齡的C57BL/6J野生型小鼠作為對照組。5xFAD小鼠是一種常用的阿爾茨海默病動物模型，其基因組中攜帶了五種家族性AD突變，能夠模擬人類AD患者大腦中Aβ的過度產生和沉積。在實驗過程中，小鼠先接受經顱灌注，隨后取出眼球和大腦組織，并將其固定在4%碘酸鹽溶液中。為了進行組織透明化處理，研究團隊使用了親水性Binaree組織透明化試劑盒，按照特定的步驟和條件對樣本進行處理，包括初始透明化、洗滌和通透化等過程。盡管在透明化過程中有4個AD小鼠眼球因機械應力等因素受損，但最終成功處理了6個AD小鼠眼球、7個對照組眼球、10個AD大腦和7個對照組大腦樣本，為后續的成像和分析提供了足夠的樣本量。
眼球和大腦中Aβ的三維分布特征
通過LSFM成像技術，研究人員觀察到AD小鼠的眼球和大腦中均存在大量的Aβ斑塊樣特征，且其分布具有一定的規律性。在眼球中，Aβ的積累不僅局限于視網膜和視神經等后部結構，還在虹膜、角膜和晶狀體等前部區域有顯著分布。這表明Aβ在眼球中的沉積具有廣泛的三維分布特征，可能影響眼部的多個功能區域。與對照組相比，AD小鼠眼球中的Aβ總斑塊數量、總表面積和總表面體積均顯著增加。在大腦中，AD小鼠同樣表現出更高的攝取和更大的Aβ斑塊樣特征的總表面積和總表面體積。這些結果充分證明了AD小鼠眼與腦中Aβ負擔的顯著增加，為深入研究其相關性奠定了基礎。
眼與腦Aβ負擔的相關性分析
研究的一個關鍵發現是眼球和大腦中Aβ斑塊樣特征的總表面積和總表面體積之間存在強正相關。相關系數分析顯示，眼球和大腦中Aβ總表面積的相關系數為0.722，總表面體積的相關系數為0.810，P值均小于0.01。這表明眼球中Aβ的三維分布與大腦中的Aβ負擔具有高度的相關性，即眼球中Aβ的積累程度可以反映大腦中Aβ的病理狀態。此外，單個斑塊樣特征的表面積和體積在眼球和大腦之間也表現出強相關性，相關系數分別為0.808和0.824，P值均小于0.01。這些結果進一步支持了眼與腦Aβ負擔之間存在密切聯系的觀點，為開發基于眼部檢測的AD早期診斷工具提供了科學依據。然而，值得注意的是，研究中并未發現眼與腦之間Aβ斑塊樣特征的形態參數（如橢球度和球形度）存在顯著相關性，這可能表明Aβ在眼和腦中的聚集形態存在差異，其背后的生物學機制有待進一步探討。
神經炎癥反應的差異性觀察
在對神經炎癥反應的觀察中，研究人員發現AD小鼠大腦中星形膠質細胞和小膠質細胞的表達顯著增加，這與已知的AD病理特征一致，表明大腦中存在明顯的神經炎癥反應。然而，在AD小鼠的眼球中并未檢測到這些神經炎癥標志物的表達。這一結果可能有多種解釋。一方面，可能是因為本研究中使用的44周齡AD小鼠處于疾病的早期階段，眼部的神經炎癥反應尚未充分發展，或者其表達水平較低而無法被當前的檢測方法所捕捉。另一方面，也可能與實驗中使用的抗體穿透能力有限有關，導致未能有效標記眼部的星形膠質細胞和小膠質細胞。此外，眼部的免疫環境與大腦有所不同，可能對神經炎癥反應的激活和表現形式產生影響。這一發現提示我們在研究阿爾茨海默病的神經炎癥機制時，需要充分考慮眼與腦之間的差異性，進一步探索眼部神經炎癥反應的特點及其與腦部神經炎癥的關系。
總結與展望
研究利用光片熒光顯微鏡結合組織透明化技術，首次實現了對完整眼球和大腦中Aβ負擔的三維可視化和量化分析，并發現了眼與腦中Aβ負擔的強相關性。這一發現不僅加深了我們對Aβ病理系統性本質的理解，而且為開發基于眼部Aβ檢測的無創早期診斷工具提供了科學依據。然而，研究也存在局限性，如樣本量較小、僅針對特定年齡段的小鼠模型等。未來的研究應擴大樣本量，涵蓋不同疾病階段和遺傳背景的模型，并進一步探索眼與腦Aβ相關性的分子機制和生物學意義。此外，還需要開發更特異的成像探針和更先進的成像技術，以提高檢測的準確性和靈敏度。盡管如此，本研究的成果仍為阿爾茨海默病的早期診斷和治療監測提供了新的視角和潛在的生物標志物，有望推動該領域向更精準、更無創的診斷方法發展。
論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Son HJ, Kim S, Kim SY, Jung JH, Lee SH, Kim SJ, Kim C, Hahn A. Three-Dimensional β-Amyloid Burden Correlation Between the Eye and Brain in Alzheimer's Disease Mice Using Light-Sheet Fluorescence Microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025 Mar 3;66(3):34.
DOI:10.1167/iovs.66.3.34.
