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實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中熒光信號(hào)物質(zhì)使用染料法及探針?lè)ǖ膮^(qū)別
前言
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是一種監(jiān)控核酸擴(kuò)增的技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)的變化對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。根據(jù)所加入的熒光化學(xué)物質(zhì)不同可分為：染料法和探針?lè)ā?br />
SYBR Green染料法原理
染料法利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下幾乎不發(fā)出熒光信號(hào)，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其熒光信號(hào)增強(qiáng)約1000倍。PCR擴(kuò)增時(shí)，每形成一條雙鏈，就有相應(yīng)染料與雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。SYBR Green I的最大吸收波長(zhǎng)約在497 nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約在520 nm，與FAM熒光染料的光譜性質(zhì)類似，因此在qPCR設(shè)備中都是第一通道檢測(cè)，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺點(diǎn)是染料會(huì)與任何雙鏈DNA序列結(jié)合。這意味著您還可以檢測(cè)到非特異性qPCR產(chǎn)物（如引物二聚體）發(fā)出的熒光。為了消除這種風(fēng)險(xiǎn)，可以通過(guò)熔解曲線分析來(lái)檢查反應(yīng)特異性，或使用TaqMan方法。
在qPCR反應(yīng)體系中，加入一對(duì)引物和一個(gè)特異性的TaqMan熒光探針，探針的5′端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3′端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí)，引物和探針與模板特異性結(jié)合，當(dāng)延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5'端外切酶活性將探針?biāo)馇懈睿瑹晒饣鶊F(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)開(kāi)始積累。所以，每形成一條DNA雙鏈，就會(huì)水解一個(gè)探針，釋放一份熒光基團(tuán)以積累熒光信號(hào)，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。
與染料法相比，TaqMan探針的使用更昂貴，但也提供了兩個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)：
1. TaqMan 檢測(cè)僅測(cè)量靶序列的擴(kuò)增進(jìn)程，因?yàn)樘结樉哂邪袠?biāo)特異性。
2. 通過(guò)向預(yù)混液中添加不同的引物和具有不同熒光基團(tuán)的TaqMan探針，您可以在單個(gè)反應(yīng)中監(jiān)測(cè)多種qPCR產(chǎn)物的量。這種多重方法允許您在每個(gè)熱循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光信號(hào)。
一般qPCR設(shè)備會(huì)配有1個(gè)或多個(gè)不同的熒光通道，根據(jù)儀器熒光通道的配置，可以通過(guò)對(duì)不同靶標(biāo)基因的探針標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，以實(shí)現(xiàn)多重PCR的檢測(cè)。常用的熒光基團(tuán)及淬滅基團(tuán)如下：
QX系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)
杰萊美QX系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，采用先進(jìn)的雙PID算法和溫控技術(shù)，結(jié)合免維護(hù)光學(xué)系統(tǒng)和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時(shí)還帶來(lái)了更好的溫控精準(zhǔn)度和均一性，以確保您實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。配合業(yè)界領(lǐng)先的熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理軟件，QX系列將熒光信號(hào)處理、專業(yè)的數(shù)據(jù)計(jì)算方法、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學(xué)問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)需要，重新定義了科研級(jí)熒光定量PCR系統(tǒng)。
該系統(tǒng)最大可實(shí)現(xiàn)單管6重?zé)晒鈾z測(cè)，6通道96孔檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)5秒，實(shí)現(xiàn)對(duì)珍貴樣本最大限度的利用和數(shù)據(jù)挖掘。另外，可兼容各種常見(jiàn)的熒光基團(tuán)或染料，激發(fā)/檢測(cè)波長(zhǎng)470-725nm。白色LED提供更寬泛的激發(fā)光波長(zhǎng)，定制濾光片組激發(fā)/檢測(cè)波長(zhǎng)范圍可達(dá)到360-750nm，還可升級(jí)FRET通道開(kāi)展蛋白質(zhì)熱遷移分析或FRET探針監(jiān)測(cè)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是一種監(jiān)控核酸擴(kuò)增的技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號(hào)的變化對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。根據(jù)所加入的熒光化學(xué)物質(zhì)不同可分為：染料法和探針?lè)ā?br />
SYBR Green染料法原理
染料法利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下幾乎不發(fā)出熒光信號(hào)，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其熒光信號(hào)增強(qiáng)約1000倍。PCR擴(kuò)增時(shí)，每形成一條雙鏈，就有相應(yīng)染料與雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。SYBR Green I的最大吸收波長(zhǎng)約在497 nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約在520 nm，與FAM熒光染料的光譜性質(zhì)類似，因此在qPCR設(shè)備中都是第一通道檢測(cè)，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺點(diǎn)是染料會(huì)與任何雙鏈DNA序列結(jié)合。這意味著您還可以檢測(cè)到非特異性qPCR產(chǎn)物（如引物二聚體）發(fā)出的熒光。為了消除這種風(fēng)險(xiǎn)，可以通過(guò)熔解曲線分析來(lái)檢查反應(yīng)特異性，或使用TaqMan方法。
圖1：使用染料法和探針?lè)ㄔ硎疽鈭D
TaqMan探針?lè)ㄔ?/strong>在qPCR反應(yīng)體系中，加入一對(duì)引物和一個(gè)特異性的TaqMan熒光探針，探針的5′端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3′端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí)，引物和探針與模板特異性結(jié)合，當(dāng)延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5'端外切酶活性將探針?biāo)馇懈睿瑹晒饣鶊F(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)開(kāi)始積累。所以，每形成一條DNA雙鏈，就會(huì)水解一個(gè)探針，釋放一份熒光基團(tuán)以積累熒光信號(hào)，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。
與染料法相比，TaqMan探針的使用更昂貴，但也提供了兩個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)：
1. TaqMan 檢測(cè)僅測(cè)量靶序列的擴(kuò)增進(jìn)程，因?yàn)樘结樉哂邪袠?biāo)特異性。
2. 通過(guò)向預(yù)混液中添加不同的引物和具有不同熒光基團(tuán)的TaqMan探針，您可以在單個(gè)反應(yīng)中監(jiān)測(cè)多種qPCR產(chǎn)物的量。這種多重方法允許您在每個(gè)熱循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光信號(hào)。
一般qPCR設(shè)備會(huì)配有1個(gè)或多個(gè)不同的熒光通道，根據(jù)儀器熒光通道的配置，可以通過(guò)對(duì)不同靶標(biāo)基因的探針標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，以實(shí)現(xiàn)多重PCR的檢測(cè)。常用的熒光基團(tuán)及淬滅基團(tuán)如下：
圖2：常用的熒光基團(tuán)及淬滅基團(tuán)
QX系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)
杰萊美QX系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，采用先進(jìn)的雙PID算法和溫控技術(shù)，結(jié)合免維護(hù)光學(xué)系統(tǒng)和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時(shí)還帶來(lái)了更好的溫控精準(zhǔn)度和均一性，以確保您實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。配合業(yè)界領(lǐng)先的熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理軟件，QX系列將熒光信號(hào)處理、專業(yè)的數(shù)據(jù)計(jì)算方法、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學(xué)問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)需要，重新定義了科研級(jí)熒光定量PCR系統(tǒng)。
該系統(tǒng)最大可實(shí)現(xiàn)單管6重?zé)晒鈾z測(cè)，6通道96孔檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)5秒，實(shí)現(xiàn)對(duì)珍貴樣本最大限度的利用和數(shù)據(jù)挖掘。另外，可兼容各種常見(jiàn)的熒光基團(tuán)或染料，激發(fā)/檢測(cè)波長(zhǎng)470-725nm。白色LED提供更寬泛的激發(fā)光波長(zhǎng)，定制濾光片組激發(fā)/檢測(cè)波長(zhǎng)范圍可達(dá)到360-750nm，還可升級(jí)FRET通道開(kāi)展蛋白質(zhì)熱遷移分析或FRET探針監(jiān)測(cè)。
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