水稻是全球最重要的糧食作物之一，但其長期受到了許多病原真菌、細菌、卵菌、線蟲和病毒的威脅，因此降低了作物的產量和品質。培育對一種病原體的大多數株系/種或一種以上病原體具有抗性的優良品種是最經濟和最環保的病害防控措施，因此迫切需要發掘廣譜抗性(BSR)基因。

2023年1月，四川農業大學王文明教授團隊在植物學頂刊Nature Plants（N1級中科院大類TOP，IF=17.352）在線發表了題為“A natural allele of proteasome maturation factor improves rice resistance to multiple pathogens”的研究論文，該研究通過轉錄組學篩選到了具有廣譜抗性的基因UMP1^R2115，并通過標記定量蛋白組學進行了機制解析，證實了UMP1^R2115對多種病原菌的抗性，且不影響水稻產量。中科新生命為該研究提供了標記定量蛋白質組學技術服務。

 研究材料

雅恢2115水稻、TP309水稻、轉入和敲除UMP1^R2115的TP309水稻

 技術路線

步驟1：轉錄組學篩選廣譜抗性基因；

步驟2：UMP1^R2115基因廣譜抗性的確認；

步驟3：蛋白組學解析UMP1^R2115對稻瘟病的抗性機制；

步驟4：UMP1^R2115抗稻瘟病機制驗證；

步驟5：UMP1^R2115對多種病原菌具有抗性且不影響水稻產量。

 研究結果

1. 轉錄組學篩選廣譜抗性基因

雅恢2115(R2115)是四川農業大學培育的一個優質多抗超級稻恢復系，它對水稻稻瘟病表現出廣譜抗性。作者使用該品系水稻探索其BSR基因。本研究中，作者對稻瘟菌侵染的R2115、易感水稻麗江新團黑谷(LTH)和3個小種特異抗稻瘟病單基因系進行了轉錄組分析（圖1a）。16924個顯著差異基因（DEG）被分為10個亞簇，其中亞簇3中的DEG僅在R2115中高表達(圖1b)。KEGG通路分析結果顯示亞簇3中的DEG在蛋白酶體和程序性細胞死亡中富集(圖1c)。進一步分析富集通路中的基因發現編碼蛋白酶體成熟因子OsUMP1的Os03g0583700（OsUMP1基因）在R2115中高表達(圖1d)。

2. UMP1^R2115基因廣譜抗性的確認

為了驗證R2115中OsUMP1基因（UMP1^R2115）的廣譜抗性，作者首先構建了OsUMP1的突變株。發現敲除OsUMP1基因的水稻（DZ108、TP309）均表現出病變區域的增大和稻瘟菌感染的增多（圖1e-1h）。隨后，作者將R2115的OsUMP1等位基因轉入至TP309水稻（UMP1^R2115水稻）中，病變區域和稻瘟菌生長量均減少（圖1i-1j）。此外，作者用稻瘟菌感染TP309、UMP1^R2115水稻和UMP1敲除的水稻，發現稻瘟菌在轉入UMP1^R2115基因的水稻中增長受限（圖1k-1l）。綜上所述，UMP1^R2115對稻瘟菌具有侵入前和侵入后的抗性。

圖1 廣譜抗性基因的篩選和確認

3. 蛋白組學解析UMP1^R2115對稻瘟病的抗性機制

已知UMP1基因同源物在擬南芥和釀酒酵母中參與蛋白酶體的形成，研究發現水稻中的UMP1也發揮了蛋白酶體形成的功能，實驗分析中UMP1^R2115水稻與TP309相比，表現出更高水平的蛋白酶體豐度和活性（圖2a-2e）。

隨后作者采用iTRAQ標記定量蛋白質組學的方式檢測UMP1^R2115水稻和TP309之間的蛋白質水平的變化（圖2f），研究發現在鑒定到的2767個蛋白中，UMP1^R2115中三種抗血酸過氧化物酶B8AU10(POD)、A3A7Y3 (OsAPX8)、B9FV80(POD)和CAT A0A0R7FMX6 (OsCatB)蛋白水平均有所降低（圖2g）。 ELISA實驗進一步證實了UMP1^R2115水稻中的參與抑制植物免疫和負調控水稻抗病性的POD和CAT蛋白表達水平的降低，活性也降低（圖2h-2k）。而H₂O₂水平增加（圖2l）。這表明了UMP1^R2115中蛋白酶體-POD/CAT-H₂O₂的潛在防御途徑。
 

圖2 UMP1^R2115稻瘟菌抗性機制解析

4. UMP1^R2115抗稻瘟病機制驗證

作者首先驗證UMP1^R2115介導的防御是否需要有活性的蛋白酶體。在稻瘟菌感染前加入了蛋白酶體抑制劑MG132，結果發現加了MG132的UMP1^R2115水稻病變區域增大、且稻瘟菌感染更多（圖3a-3c）。因此，UMP1^R2115介導的稻瘟病抗性需要活躍的26S蛋白酶體，POD和CAT蛋白的降解明顯依賴于蛋白酶體。

然后驗證POD和CAT在UMP1^R2115稻瘟菌抗性中的作用，作者將POD/CAT編碼基因在水稻中過表達，結果發現其破壞了UMP1^R2115介導的稻瘟菌抗性（圖3d-3i）。
 

圖3 UMP1^R2115稻瘟菌抗性機制確認

5. UMP1^R2115對多種病原菌具有抗性且不影響水稻產量

接下來為了研究蛋白酶體-POD/CAT-H₂O₂防御通路是否由病原體信號誘導的，作者用幾丁質或flg22處理TP309和UMP1^R2115水稻。研究發現在UMP1^R2115水稻中，蛋白酶體水平增強、POD和CAT量減少，H₂O₂量更高，證實了UMP1^R2115介導的防御是幾丁質和flg22誘導的（圖4a-4e）。

由于幾丁質和flg22分別是真菌和細菌的主要激發子，作者研究了UMP1^R2115對多種細菌和真菌病原體的抗性（圖4f-4k）,結果證實UMP1^R2115增強了對具有獨特生活方式的病原體亦具有抗性。

此外作者還發現轉入UMP1^R2115基因的TP309水稻和正常的TP309水稻，在植物形態、產量上均相當，即UMP1^R2115的轉入既具有病菌的廣譜抗性亦不影響水稻產量（圖4l-4s）。

圖4 UMP1^R2115對多種菌具有抗性且不影響水稻產量

小編小結

該研究在雅恢2115中篩選到了一個編碼蛋白酶體成熟因子的天然等位基因UMP1^R2115，該基因對多種病害具有廣譜抗性對水稻產量沒有影響。此外通過蛋白組學的機制解析發現了UMP1^R2115具有廣譜抗性的通路，即活性26S蛋白酶體-POD和CAT降解-H₂O₂提高，從而增強水稻對多種病原菌的抵御能力。UMP1^R2115的發現為培育抗多種病害的高產水稻品種提供了新的基因資源。