mRNA-LNP（核酸脂質納米粒）的構效關系介紹

瀏覽次數：1718　發布日期：2023-8-8　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

RNA-LNP常通過兩相自組裝反應進行制備，一相為載體脂質相，另一相為包含API（活性藥用成分）的水相，制備所需的設備則是我們已熟知的——微流控設備。

構效關系，可理解為藥物的理化性質與其藥用活性之間的聯系。功效先行，理論滯后，是社會中常見的行事邏輯和行為方式，在mRNA-LNP研究領域也不例外，包括已上市的藥物在內，其構效關系也未有清晰準確的闡明。

mRNA-LNP合成過程所涉及的微觀動力學尚未清楚，而合成后mRNA-LNP表征手段的不足則更為構效關系的探索增添一份難度。諸多的疑問等待解答：單個納米顆粒可以裝載多少mRNA，mRNA-LNP的包封率和空殼率有著怎樣的關系？后處理過程會改變脂質的分布嗎？脂質本身的分布是怎樣的？如何準確、定量地表征單個納米顆粒的組分和載藥量？這些問題的解答對于實驗的設計，工藝的優化，質控的提升，臨床風險的降低有著重要的指導作用。對于研究者而言，在細胞/動物實驗的基礎上，豐富表征手段仍為突破問題的核心。

如圖1，mRNA-LNP有各式各樣的結構模型，用一些常見的表征，如粒徑、PDI、包封率檢測等，很難了解其真實樣貌。

圖1. mRNA-LNP模型圖

冷凍電鏡（Cryo-EM）

冷凍電鏡適用于觀測溫度敏感型樣品，是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設備，以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實的樣品形貌。

圖2.LNP的Cryo-EM表征

圖2中，A-C直觀展示了納米粒子（復必泰）的形態及粒徑分布，也呈現了粒子內部的一些模糊形態；而D則更為清晰的顯示出脂質體內水相中硫酸多柔比星晶體的棒狀形態。

小角度X射線散射（SAXS）

SAXS是指當X射線透過樣品時，在靠近原光束2°～5°的小角度范圍內發生的散射現象。X射線穿過樣品時，在不均一材料電子密度起伏的作用下，會發生散射并形成特定的散射圖案，根據所得圖案可反推樣品微觀結構。在進行mRNA-LNP表征時，SAXS常與Cryo-EM結合使用，正如圖3所示，結合SAXS檢測所得曲線與Cryo-EM拍攝所得圖像，即可幫助研究者推斷/驗證諸多信息，如LNP的多層狀結構，各種脂質的排布，純化前后脂質排布的變化及不同脂質濃度、不同NP比對脂質排布的影響。

圖3.LNP的SAXS表征

多激光圓柱照明共聚焦光譜（CICS）

此方法旨在從單粒子水平上定量解析LNP的有效載荷，通過對LNP不同組分熒光標簽的一致性分析和單mRNA熒光的定量解析（圖4），區分未封裝的mRNA、空載的LNPs和負載mRNA的LNPs。以DLin-MC3基準配方來講，不同條件下，LNP自組裝的空載率為40%~80%，非空載的LNP大多含有2~3個mRNA分子。CICS為揭示LNP動力學控制提供了觀測條件，也為mRNA-LNP構效關系的研究給予了新的幫助。

圖4. LNP的CICS表征

單粒子分析器（SPP）

SPP采用市售共聚焦顯微鏡，基于溶液中數千個擴散粒子的熒光波動進行分析（圖5a）。簡而言之，熒光標記的粒子在衍射受限的觀察體中擴散，其發射的熒光在多通道中被連續檢測，使用自定義的免費Python腳本可識別多通道的熒光強度波動（圖5b），基于多通道中每個單峰的強度，可以構建信號密度圖（圖5c）和每個通道的直方圖（圖5d）。
在包封分析中，SPP通過測量mRNA和脂質染料的共現信號（圖5f），可以對單個LNP中mRNA的含量進行定量分析，以得到完整LNP的占比（圖5g），以及單個LNP的mRNA包封量（圖5h）。

圖5.LNP的SPP表征