Elispot（酶聯(lián)免疫斑點檢測）樣本制備介紹
Elispot（酶聯(lián)免疫斑點檢測）是一種高靈敏度的技術(shù)，用以檢測單個細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或其它生物分子。Elispot技術(shù)作為疫苗研究免疫原性驗證的金標(biāo)準(zhǔn)，其中單核免疫細(xì)胞的質(zhì)量對實驗結(jié)果起著決定性的作用。因此單核免疫細(xì)胞的制備流程中一些可能影響細(xì)胞活率和功能的細(xì)節(jié)需要特別注意。
目前常見的樣本類型包括人的外周血單核細(xì)胞（PBMC）、動物脾臟提取單核細(xì)胞以及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞等。Elispot實驗對于細(xì)胞的活率要求較高，通常在90%以上的活率，能保證準(zhǔn)確的結(jié)果，有些樣本受限不能拿到高活率的，則可將細(xì)胞活率降至80%。我司對于人外周血以及小鼠脾臟組織提取單核細(xì)胞實測數(shù)據(jù)如下：
表1:不同樣本類型的細(xì)胞活率比較
二、PBMC細(xì)胞提取注意事項
1. 人外周血離體后，放入抗凝劑的管子中，推薦使用肝素鈉，不建議使用EDTA，同時放置在室溫中，不要放置在低溫環(huán)境中，否則會影響細(xì)胞提取的活率，放置時間不要超過8小時。2. 細(xì)胞脾臟組織需要新鮮分離的脾臟，禁止凍存，同時將脾臟組織上的脂肪組織去除干凈，研磨制備單細(xì)胞懸液的過程要盡量迅速，盡量在5分鐘內(nèi)完成，離心前的所有操作。3. 所有用以提取分離單核淋巴細(xì)胞的試劑均應(yīng)提前置于室溫平衡。4. 離心機溫度設(shè)置為25℃，切勿設(shè)置低溫！5. 密度梯度離心的第一步離心，降速和升速制動均設(shè)置為2或以下。6. 使用凍存的細(xì)胞來進行實驗時，需提前復(fù)蘇細(xì)胞，然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱里至少靜置1小時，再用來進行后續(xù)實驗。7. 細(xì)胞凍存時使用含10%DMSO/90%血清的凍存液，使用程序降溫盒逐步降溫，后置于液氮罐中保存。短期如3天內(nèi)可放置于-80℃冰箱保存。長期保存則放置于液氮罐中。8. PBMC細(xì)胞制備過程中，需要將紅細(xì)胞去除干凈，若分離過程中仍有紅細(xì)胞存在可考慮使用裂紅的方法去除。
表2. 不同凍存溫度下pbmc細(xì)胞活率
1.細(xì)胞活率方面超低溫運輸（-196℃）結(jié)果明顯優(yōu)于低溫運輸（-80℃），但在T細(xì)胞活率方面兩者無明顯差別。
2.將不同溫度條件下寄送的PBMC樣本復(fù)蘇后，進行Elispot實驗，都分別使用兩種不同的抗原進行免疫刺激，然后比較不同運輸條件下對抗原的相應(yīng)差異，結(jié)果表明超低溫運輸條件下有更好的抗原免疫反應(yīng)。
1. 背景信號升高死細(xì)胞會釋放蛋白酶，核酸酶等物質(zhì)，可能降解包被抗體或捕獲的細(xì)胞因子，導(dǎo)致非特異性結(jié)合或者背景斑點增加。
2. 有效細(xì)胞數(shù)量減少細(xì)胞活率低，功能性細(xì)胞數(shù)目不足，可能導(dǎo)致斑點數(shù)量減少，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
3. 細(xì)胞功能受損CD4+T細(xì)胞尤其是DC細(xì)胞功能受限，導(dǎo)致分泌細(xì)胞因子的功能受損。
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