一．嵌合抗體簡介

人-鼠嵌合抗體，即抗體的可變區來自鼠單克隆抗體，而恒定區則來自人的抗體。它是通過從雜交瘤細胞分離出功能性可變區基因，與人Ig恒定區基因連接,插入適當表達載體，轉染宿主細胞表達產生。嵌合抗體既保留了親本抗體特異性結合抗原的能力，又大大減少了鼠源性在人體內的免疫原性，其半衰期明顯延長，且在介導CDC及ADCC方面亦明顯增強。

圖1 嵌合抗體示意圖

二．嵌合抗體制備（關鍵技術與方法）

1. 可變區基因克隆

1.1 RNA提取及反轉錄

取對數生長期的雜交瘤細胞株約10⁷個細胞，按照Trizol RNA提取試劑盒的說明書抽提細胞的總RNA，再進行RT-PCR擴增，回收純化擴增產物備用。

1.2 擴增輕鏈、重鏈的V區基因

根據Orlandi等（1989）設計的擴增小鼠可變區基因的引物，以上述擴增產物為模板擴增抗體基因的可變區。回收重鏈VH（約360 bp）、輕鏈VL （約330bp）片段，插入Teasy載體，各送3份樣品測序。測序所得序列在GeneBank核酸數據庫中進行分類及同源性分析。

兩端加入酶切位點：根據上述PCR產物序列設計含酶切位點的引物，再次進行擴增，以使抗體可變區基因片段具有與載體相吻合的酶切位點，便于插入表達載體。回收純化擴增產物備用。

2. 嵌合抗體表達載體構建

2.1 改造含信號肽人Ig重鏈和輕鏈C區基因片段的單克隆位點

設計含重鏈信號肽起始位點序列及酶切位點Nhe I的上游引物HLF （KOZAK+4G,即GCCGCCATGG），和含Xho I位點的下游引物HLR，以質粒pAc-K-CH3為模板，擴增出重鏈信號肽基因片段；設計含XhoI和KpnI位點上游引物HCF，和含Furin（RKRR）序列及酶切位點Xba I的下游引物HCR，以質粒pAc-K-CH3為模板，擴增出重鏈恒定區基因片段片段；用Xho I連接上述片段得到含重鏈信號肽、MCS及重鏈恒定區的基因片段。

設計含酶切位點Apa I的上游引物LLF，和含EcoR I位點的下游引物LLR，以質 粒pAc-K-CH3為模板，擴增出輕鏈信號肽基因片段；設計含EcoR I和Hind I位點上游引物LCF，和含Pme I的下游引物LCR，以質粒pAc-K-CH3為模板，擴增出輕鏈恒定區基因片段片段；用EcoR I連接上述片段得到含輕鏈信號肽、MCS及輕鏈恒定區的基因片段。

2.2 構建含信號肽及人Ig重鏈和輕鏈C區基因片段表達空載體

用合成的含酶切位點（XbaI和ApaI）的2A序列連接上述重、輕鏈，得到含信、號肽及人Ig重鏈和輕鏈C區基因的基因片段LigC （Leader + Ig Constant）。然后與Nhe I和Pme I雙酶切過的pcDNA3.1-CA大片段連接，即得到嵌合抗體真核雙表達載體 pcDNA3. 1-CA（ chimeric antibody, CA）。

圖2 pcDNA3.1圖譜

2.3 插入含數源Ig重鏈和輕鏈V區基因

雙酶切表達載體pcDNA3.1-CA和純化的VL，經瓊脂糖凝膠電泳分離純化目的片段后，連接、轉化大腸桿菌，篩選出pcDNA3.1-CA-VL陽性克隆，富集培養后提取質粒進行酶切鑒定。然后，雙酶切表達載體pcDNA3.1-CA-VL和純化的VH，分離純化相應的酶切片段，重復上述步驟，構建成重組表達載體pcDNA3.1-CA-XX（抗原單詞的首字母）。

3. 轉染Sp2/0細胞

接種適量Sp2/0細胞于培養瓶中，培養12h后用純化的載體pcDNA3.1-CA-XX DNA，采用Lipofectamine 2000試劑轉染，按試劑盒使用說明書進行。設置空載體和無載體的細胞為對照。轉染72h后，加含MTX的選擇性培養基進行篩選。2周后將生長出的陽性克隆利用有限稀釋法單克隆化。

4. 陽性克隆鑒定與篩選

以間接法用抗原和酶標羊抗人IgGFc片段抗體檢測嵌合抗體的特異性及重組性。以適量抗原包被酶標板，加細胞培養上清反應后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶標抗體（經鼠Ig吸附過）孵育，顯色后測A490吸光值。

5. 抗體腹水生產

腹腔種植轉染瘤細胞，5~7天后抽取腹水。一只種植雜交瘤細胞的小鼠有時可產生多達10ml的腹水。王碩等（2003）報道稱從腹水中獲得的嵌合抗體產量可達1~2mg/ml。

三．嵌合抗體的應用

嵌合抗體目前主要用于藥物治療方面，與鼠抗相比，嵌合抗體既保留了鼠源可變的高親和性，又具有人Fc段的多種免疫殺傷功能，從而大大降低了人抗鼠抗體反應的發生幾率，改善了臨床治療效果，與其它小分子基因工程抗體相比，嵌合抗體作為完成的抗體分子，在體內半壽期更長，并具有人Fc段的多種免疫殺傷功能。